Page 140 - 《精细化工》2020年第6期

·1206· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 37 卷

浓度为 0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl 溶液进行梯度洗脱，  A  A 
OH清除率 / %   1  1 2   － 100 （4）
以 5 mL/min 流速收集，每 10 mL 收集一管，用苯酚-  A 0 
硫酸法 [12] 于 490 nm 下跟踪监测，以管号为横坐标，
式中：A 1 为多糖溶液样品的吸光度；A 2 为无 H 2 O 2
吸光值为纵坐标绘制洗脱曲线，收集主峰位置管号 反应体系的对照组吸光度；A 0 为 2.0 mL 蒸馏水代替
的洗脱液，收集得到 4 种多糖组分，其中第 4 种组 多糖溶液的空白组吸光度。
分峰多糖含量远大于前 3 种，因此将之浓缩冻干得 1.2.4.3 清除•O 2 能力的测定
–
到纯化的 AMP。 参照文献[15]方法，以 V C 作为阳性对照，在
1.2.2 AMP 单糖组成分析 325 nm处测定不同浓度多糖与邻苯三酚反应体系溶
采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍 液吸光值（A）。•O 2 清除率按式（5）计算：
–
生法对 AMP 中单糖组成进行分析。参照文献[13]，  A  A 
对多糖进行三氟乙酸水解及 PMP 衍生化。以标准单  O  2 / %清除率  1   1 A 2   1 0 0 （5）
糖的糖醇全乙酰化衍生物作对照。  0 
式中：A 1 为 0.5 mL 多糖溶液样品与 7 mmol/L 的邻
对混合单糖标准溶液和 AMP 水解液进行 HPLC
苯三酚溶液 1.0 mL 反应液的吸光度；A 2 为无邻苯三
检测，比较混合对照品与样品的保留时间，确定
酚反应体系溶液对照组吸光度；A 0 为蒸馏水代替多
AMP 单糖组成。色谱条件：Agilent XDB-C 18 色谱柱
糖溶液的空白组吸光度。
（250 mm×4.6 mm×5 μm）；流动相：20 mmol/L 磷
+
1.2.4.4 清除 ABTS •能力的测定
酸缓冲溶液（pH 6.7）-乙腈（体积比 82∶18）；流
首先配制 7 mmol/L 的 ABTS 水溶液和 4.9 mmol/L
速：1 mL/min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；
的过硫酸钾水溶液，二者等体积混合制备 ABTS 母
进样量：20 μL。
1.2.3 AMP 紫外-可见光光谱与红外光谱分析 液，使用前用无水乙醇稀释至 0.5909 mmol/L 工作
配制 10 g/L 的多糖水溶液用紫外-可见分光光 液。精确量取不同浓度的多糖溶液 1.0 mL，然后加
入已配制好的 ABTS 工作液 4.0 mL，使其充分混匀，
度计在波长 200~700 nm 进行扫描。称取 AMP 6.8 mg
静置 30 min 后在 734 nm 处测定其吸光值（A）。空
与 KBr 研磨充分，压片，用红外光谱仪在 4000~
–1
400 cm 范围内进行扫描。 白组用 1.0 mL 蒸馏水代替多糖溶液，对照组用无
+
+
1.2.4 AMP 抗氧化活性的测定 ABTS •体系溶液，V C 作为阳性对照。ABTS •清除
1.2.4.1 清除 DPPH•能力测定 率按式（6）计算：
参照文献[14]方法，以抗坏血酸（V C ）作阳性 ABTS 清除率 / %   1  A  A  2   100 （6）
1
+
对照，在 517 nm 处测定多糖溶液与 DPPH-乙醇（体  A 0 
积分数 95%）反应液吸光值（A）。菜芙蓉多糖 DPPH• 式中：A 1 为多糖溶液样品的吸光度；A 2 为无 ABTS
清除率按式（3）计算： 反应体系溶液对照组吸光度；A 0 为 1.0 mL 蒸馏水代
 A  A  替多糖溶液的空白组吸光度。
DPPH清除率 / %  1  1 2   100 （3） 1.2.4.5 清除 NO•能力的测定
 A 0 
式中：A 1 为 2.0 mL 多糖溶液与 2.0 mL DPPH-乙醇 参考文献[16]，利用硝普钠作为 NO•供体，通
（体积分数 95%）溶液吸光度；A 2 为 2.0 mL 多糖溶 过 Griess 反应测定 NO•清除能力。V C 作为阳性对照，
NO•清除率按式（7）计算：
液与 2.0 mL 乙醇（体积分数 95%）溶液吸光度；A 0
为 2.0 mL 蒸馏水代替多糖溶液与 2.0 mL DPPH-乙 NO•清除率/%=〔1–(A 1 –A 2 )/A 0 )〕×100 （7）
醇（体积分数 95%）溶液吸光度。 式中：A 1 为多糖溶液样品的吸光度；A 2 为蒸馏水代
1.2.4.2 清除•OH 能力的测定 替硝普钠反应体系溶液的对照组吸光度；A 0 为 1.0 mL
利用 Fenton 反应体系产生•OH，水杨酸显色法 蒸馏水代替多糖溶液的空白组吸光度。
测定•OH 清除能力。精密量取 2.0 mL 浓度为 6 mmol/L 1.2.4.6 总还原力的测定
的 FeSO 4，加入不同浓度的多糖溶液 2.0 mL 和 2.0 mL 参照文献[17]，采用铁氰化钾-三氯化铁法，以
浓度为 6 mmol/L 的 H 2 O 2 ，迅速混匀，10 min 后加 V C 作为阳性对照测定多糖溶液总还原力。
入 2.0 mL 浓度为 6 mmol/L 的水杨酸，再次混匀， 1.2.5 AMP 对质粒 DNA 的保护作用
37 ℃水浴锅中反应 30 min，在 510 nm 处测定吸光 取 0.3 µg pBR322 质粒，DNA 3 µL，质量分数
值（A）。空白组用 2.0 mL 蒸馏水代替多糖溶液，对 为 1.2%的 H 2 O 2 8 µL，加入不同质量浓度的 AMP
照组无 H 2 O 2 反应体系溶液，以 V C 作阳性对照。•OH 7 µL，混匀，37 ℃温浴 1 h 后加入 3 µL 凝胶上样缓
清除率按式（4）计算： 冲液混合均匀，加入到含有 Gelred 核酸染料（美国