Page 144 - 《精细化工》2021年第6期

·1206· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷

1.2.3 溶解度和浊度的测定 度过高而导致的多重散射，将 pH 处理后的白果蛋
参照 WANG 等 [18] 方法测定溶解度，采用双缩 白溶液用 0.01 mol/L、pH 7.0 的磷酸盐缓冲液（含
脲法测定 pH 偏移处理前后白果蛋白在 0.5 mol/L 0.5 mol/L NaCl）稀释 25 倍后，采用动态光散射仪
NaCl 溶液中的溶解度。具体步骤是：将 pH 偏移处 测定样品的粒径和电位。对照组为未经 pH 偏移处
理前后的蛋白溶液（蛋白质量浓度 10 g/L）用 理的 10 g/L 白果蛋白溶液。
50 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释到 5 g/L。 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
稀释好的溶液在 4 ℃下 5000×g 离心 10 min，用双 根据 LAEMMLI [21] 的方法分离蛋白。分离胶：
缩脲方法检测上清液中的蛋白浓度和溶液的总蛋 125 g/L 丙烯酰胺/3.33 g/L N,N′-甲叉双丙烯酰胺，含
白浓度。溶解度定义为上清液中蛋白浓度与总蛋白 0.37 mol/L Tris-HCl、10 g/L 十二烷基硫酸钠、126 g/L
浓度的比值。 甘油、0.24 g/L 过硫酸铵、0.62 g/L 四甲基乙二胺。
将 pH 偏移处理前后的蛋白溶液用 25 mmol/L 浓缩胶：50 g/L 丙烯酰胺/1.33 g/L N,N′-甲叉双丙烯
pH 7.0（含 0.5 mol/L NaCl）的磷酸盐缓冲液稀释至 酰胺，含 0.13 mol/L Tris-HCl、10 g/L 十二烷基硫酸钠、
1 g/L，于 600 nm 下使用酶标仪检测浊度。 126 g/L 甘油、0.98 g/L 过硫酸铵、0.59 g/L 四甲基乙
1.2.4 巯基和表面疏水性的测定 二胺。采用还原和非还原的方法分别制备样品 [14] ，
将经过 pH 偏移处理的蛋白液于 5000×g 离心 还原剂 β-ME 体积分数 5%，加入 0.5 mmol/L N-乙基
10 min，取上清液测得蛋白浓度为 2~4 g/L，取 2 mL 顺丁烯二酰亚胺非还原剂来抑制样品制备中可能生
上清液与 50 μL 二硝基苯甲酸（DTNB）避光反应 成的二硫键。采用恒流法电泳及考马斯亮蓝 R250
15 min，以未经 pH 处理的 10 g/L 白果蛋白溶液为 染色、体积分数 7.5%冰醋酸（含有体积分数 10%甲
对照组。取上清液在 412 nm 波长下测定吸光度，以 醇）脱色至无背景色。对照组为未经 pH 偏移处理
13600/(mol·cm)消光系数计算巯基含量 [19] 。 的 10 g/L 白果蛋白溶液。
参考 WANG 等 [20] 方法，采用 1-苯氨基萘-8-磺 1.2.8 乳化活性及乳化稳定性的测定
酸（ANS）作为荧光探针测定蛋白质的表面疏水性。 参考 WANG 等 [18] 方法测定乳化性。分别取 15 mL
以未经 pH 处理的 10 g/L 白果蛋白溶液为对照组。 不同 pH 偏移处理不同时间的蛋白液、5 mL 大豆油
用 0.01 mol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲液（含 0.5 mol/L 混合到一起，在 13500 r/min 下用均质机乳化 2 min
NaCl）稀释蛋白，使其质量浓度梯度为 0.1、0.2、 （40 s/次，共 3 次，每次间隔 5 s）。乳化后的溶液迅
0.3、0.4、0.5 g/L。取不同浓度的稀释样品 2 mL， 速转移到 25 mL 烧杯中。在室温（20 ± 2 ℃）下放置
加入 20 μL 质量浓度为 0.1 g/L 的 ANS 溶液（采用 1 min（用于乳化能力测定）和 30 min（用于乳化稳
0.01 mol/L pH 8.0 的磷酸盐缓冲液配制）避光反应 定性测定）。对照组为未经 pH 偏移处理的 10 g/L 白
15 min。在 365 nm 的激发波长和 484 nm 的发射波 果蛋白溶液。
长下测定以上不同浓度蛋白样品的荧光强度，并以 对于乳化能力的测定，均质好的乳状液在烧杯
荧光强度为纵坐标、蛋白浓度为横坐标做直线，其 中静置 1 min 后，从杯底取 25 µL，之后用 5 mL 1 g/L
斜率即为蛋白表面疏水性。 的十二烷基硫酸钠（SDS）稀释，读取在 500 nm 下
1.2.5 紫外和色氨酸（Trp）荧光的测定 吸光度值（A 500 ）。乳化活性（EAI）的计算公式为：
紫外光谱：以 0.01 mol/L pH 7.0 的磷酸盐缓冲 4.606 A

液（含 0.5 mol/L NaCl）为空白，在 22 ℃下测定 pH EAI (m /g)  2  ) 10 500 4  稀释倍数 （1）
(1 
ρ
偏移处理前后蛋白溶液（1 g/L）的紫外吸收及其二 式中：ρ为乳化前的蛋白质量浓度，kg/L；ϕ 为乳
[9]
阶导数图 。 状液中油的体积分数，%。
[9]
荧光光谱：参照 JIANG 等 方法做适当修改。将
在烧杯中静置 30 min 后，同上稀释，500 nm 读
经过 pH 偏移处理前后的蛋白溶液稀释在 0.01 mol/L
数。乳化稳定性（ESI）的计算公式为：
pH 7.0 的磷酸盐缓冲液（含 0.5 mol/L NaCl）中，终
/ ) 100
质量浓度调整为 1 g/L，采用酶标仪在激发波长 295 nm ESI/%  (AA 0 （2）
t
条件下以 1 nm/s 的扫描速度得到 320~400 nm 之间 式中：A 0 和 A t 分别为 0 和 30 min 时的吸光度值。
的发射光谱，以 pH 7.0、0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液 1.3 数据处理
为空白。以未经 pH 偏移处理的白果蛋白溶液（1 g/L） 使用 Statistix 9 软件（美国佛罗里达州塔拉哈西
为空白组。 分析软件公司）进行统计分析。显著性水平设为
1.2.6 粒径和 ξ-电位的测定 α=0.05；用最小显著性差异法检验数据间的差异显
参考 WANG 等 [20] 方法并稍做修改，为了避免浓 著性，用 p<0.05 表示。