Page 146 - 《精细化工》2021年第6期

·1208· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷

度大体上小于碱性条件，这说明在 pH 10.0、11.0、 氨基酸被埋藏并位于非极性微环境中，这导致较低
12.0 处理过程中，蛋白质内部有更多的疏水性基团暴 的最大发射强度 [31] 。pH 偏移处理后蛋白的荧光强度
露在蛋白质表面。即表面疏水性的增加是由于蛋白 明显增加，这说明蛋白内部的疏水基在处理过程中
质内的疏水基暴露引起的，这表明蛋白质的三级结 暴露出来，埋藏在蛋白内部的侧链暴露在极性环境
构发生变化 [27] 。这一结果表明，极端碱性 pH 偏移处 中，从而改变蛋白的荧光强度，这与疏水性的结果一
理比酸性处理更容易引起白果分离蛋白的构象变化。 致（图 2A）。同时发现，与空白组相比，酸处理蛋白
如图 2B 所示，对照组白果分离蛋白（GSPI） 荧光强度的变化并没有碱处理蛋白变化的大。这可
的巯基含量为 4.68 μmol/g 蛋白。这一指标在 pH 偏 能是由于蛋白质在酸处理时更容易形成熔球状结构，
移处理后均有所增加，特别是 pH 2.0 处理下巯基含 导致蛋白质表面疏水性氨基酸接触更少 [32] 。碱性处
量增加到 18.49 μmol/g 蛋白，这可能与蛋白质的展 理后，蛋白的荧光强度明显升高，这可能是由于蛋白
开或亚基解聚有关 [28] 。此外，巯基参与蛋白质弱二 中的疏水性基团暴露，也可能是由于处理后蛋白分
级结构和三级结构的形成，巯基的变化在一定程度 子部分膨胀，从而降低内部猝灭，荧光强度增加 。
[7]
上也可能表明蛋白质变性 [29] 。与大豆分离蛋白（SPI） 蛋白质的构象变化也可以通过紫外吸收的变化
在极碱性或酸性条件下维持一段时间后，分子内的 来推断。因为紫外谱峰的信号叠加难以辨别每个样
[9]
二硫键会断裂，导致巯基含量增加 的报道类似。 品的变化特征，因此对紫外吸收光谱进行求导得到
2.3 pH 偏移处理对白果分离蛋白荧光、紫外的影响 其二阶导数图，如图 3B 所示。与空白样品相比，
内源性荧光对 Trp 残基微环境的变化和蛋白质 pH 偏移处理的样品在 296 nm 处的二阶导数图峰出
三级结构的变化高度敏感，因此，它常被用作检测 现了 1~2 nm 的红移。这一现象在碱处理条件下更为
蛋白质空间结构变化的一种手段 [17] 。图 3A 为不同 明显，表明不同 pH 偏移处理后蛋白质三级结构展
pH 偏移处理对白果分离蛋白荧光强度的影响。 开过程中疏水区域酪氨酸（Tyr）和 Trp 残基不同程

度的移动。二阶导数紫外分析结果与 ANS 和 Trp 荧
光分析结果一致，均表明当白果分离蛋白受到极端
pH 偏移处理时，致使蛋白结构展开和亚基解聚。
2.4 pH 偏移处理对白果分离蛋白粒径、ξ-电位的
影响
不同 pH 偏移处理下的白果分离蛋白粒径如图
4A 所示；白果分离蛋白的 ξ-电位如图 4B 所示。
如图 4A 所示，对照组白果分离蛋白的平均粒
径为 112.03 nm，pH 偏移处理显著提高白果分离蛋
白的平均粒径。表明 pH 偏移处理改变了蛋白质分
子间的相互作用和蛋白质的聚集状态。结合白果分
离蛋白的溶解度、浊度变化的实验结果，分析不同
pH 偏移处理白果分离蛋白，能够得到大量的不溶以
及可溶性的蛋白聚集体。其中，pH 2.0 处理的蛋白
可能因为亚基解聚后重排而产生较多的不溶性聚集
体，导致其粒径增大的同时溶解度减小。而其他 pH
处理后的白果分离蛋白粒径增大幅度较小，并且溶
解度明显增大，这种情况下可以推断白果分离蛋白
在酸碱处理后形成的可溶性聚集体增多，蛋白质与

图 3 不同 pH 偏移处理对白果分离蛋白荧光强度（A） 水分子之间的相互作用更强，在水中的溶解度更高。
和紫外光谱二阶导数（B）的影响 在之前对花生分离蛋白的凝胶性研究中 [16] 发现，pH
Fig. 3 Effect of different pH shifting treatments on the
fluorescence intensity (A) and second-derivative 偏移处理使花生分离蛋白的粒径增大，其中只有 pH
ultraviolet spectra (B) of Ginkgo seed protein 10.0 偏移处理降低其粒径，蛋白质颗粒尺寸的减小
isolate 促进蛋白质凝胶性质的改善。

如图 3A 所示，空白组蛋白的最大发射波长为 如图 4B 所示，与对照组相比，pH 2.0、pH 10.0
352 nm。蛋白质中的芳香族部分通常隐藏在分子内 和 pH 11.0 的 ξ-电位略有下降，pH 3.0 较对照组明
部，因此表现出较低的荧光强度 [30] 。此外，芳香族 显升高，表明白果分离蛋白表面基团的电离度发生