Page 88 - 《精细化工》2021年第7期
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·1370·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 38 卷

            (7.30), O (21.81)。                                    （1）当在检测卡的样品孔中加入适量的测试样
            1.2.2  LP 标记 SARS-CoV-2 的 N-蛋白抗原                   品时，样品将沿着 NC（硝酸纤维素）膜向前移动。
                 采用 Marsshall 法，用双光子荧光标记探针 LP                  如果样品含有 IgM 抗体，抗体将与 LP-Ag 结合，形
            来标记 SARS-CoV-2 的 N-蛋白抗原（简称 Ag）获                    成的免疫复合物在 M 线与包被的鼠抗人 IgM 单克隆
            得 LP-Ag。其原理如式（1）所示，即 LP 上的琥珀                       抗体（抗人 IgM 二抗）形成 M 线，表明新型冠状病
            酰亚胺氧基（—ONS）在碱性缓冲液中极易被抗原                            毒 IgM 抗体呈阳性。
            蛋白的氨基酸上的氨基（—NH 2 ）所取代，形成酰
            胺（—CONHR）。
                            LP+Ag→LP-Ag               （1）
                 标记工艺：
                （1）取 50 μL 抗原溶液〔5 g/L，0.01 mol/L 磷酸
            盐缓冲液（PBS，pH 7.2）〕，加入碳酸盐缓冲液
            （pH 9.3，Na 2 CO 3  8.6 g，NaHCO 3  17.3 g，蒸馏水
            1000 mL）5 μL，加入 LP 的 N,N-二甲基甲酰胺溶液
            （2 g/L）15 μL（可以左右调溶液量），混匀，于摇
            床 200 r/min，25  ℃下反应 2 h。

                （2）超滤纯化，将上面液体加入超滤管，加 PBS
                                                                        图 1   免疫层析试纸条装置示意图
            （0.02 mol/L，pH 7.2）到总体积 80%，然后离心                   Fig. 1    Schematic diagram of immunochromatographic strip
                         4
            〔(0.8~1.0)×10  r/min，4  ℃〕5~20 min，具体时间
            根据超滤管里剩余液体决定，重复加 pH 7.2 的 PBS                         （2）如果样品中含有 IgG 抗体，抗体将与 LP-Ag
            洗涤离心 3~5 次即可（如 20 min 离心时间，超滤管                     结合，形成的免疫复合物在 G 线与包被的鼠抗人 IgG
            里溶液量减少不多，可以适当提高转速），得到                              单克隆抗体（抗人 IgG 二抗）形成 G 线，说明新型
                                         +
            LP-Ag。HRMS-ESI, m/Z: [M+H] 计算值 45719.64，           冠状病毒 IgG 抗体呈阳性。
                                   +
            实测值 45719.62；[M+Na]   计算值 45741.63，实测值                （3）如果测试没有形成 G 线和 M 线，则显示
            45741.60。                                          阴性结果。检测卡还包含质控线 C，包被有羊抗鼠
            1.2.3   荧光抗原检测 COVID-19 的抗体                        IgG 单克隆抗体（抗鼠 IgG 一抗），样品向前流动带
                 当血液中含有 COVID-19 的抗体时，抗体就会                     动 LP-Ag 向前移动，过量的 LP-Ag 到达 C 线后，其
            与 LP-Ag 发生免疫反应，生成抗原-抗体复合物                          偶联的抗原与 C 线的抗体结合。大量积聚后显绿色，
            LP-Ag·Ab，发出荧光，呈阳性，反应如式（2）所示：                       这也是为什么 C 线一定显色的原因。无论是否出现
                         LP-Ag+Ab→LP-Ag·Ab            （2）      测试线，都应出现质控线 C（证明探针确实经过了
            1.3   光学实验                                         整个试纸条）；如果质控线 C 没有出现，则测试结
                 LP 的线性吸收光谱由紫外-可见分光光度计测                        果无效，样品需要重新测试。
            得。单光子荧光光谱和荧光量子产率由荧光分光光                             1.4.2   临床实验办法
            度计测得。双光子激发荧光光谱的激发源为锁模飞                                 将制作的新型冠状病毒 COVID-19 双光子荧光
            秒钛蓝宝石激光器，激光脉冲宽度 120 fs，重复频率                        检测试剂盒（TPICK）（荧光免疫层析法）按《体外
            76 MHz，激光器的平均输出功率 1.5 W（800 nm），                   诊断试剂注册管理办法（试行）》的要求进行临床
            可调波长范围 700~980 nm，在实验中飞秒激光波                        验证。评价该试剂盒的临床应用性、有效性、适用
            长调至所需测试波长。双光子荧光寿命由条纹相机                             性及操作时间。
            测定。                                                    在本次临床研究中，共收集血清、血浆、全血样
            1.4   免疫层析试纸条的临床研究方法                               本 320 份，使用新型冠状病毒 COVID-19 双光子荧
            1.4.1   免疫层析试纸条（TPICS）装置                           光检测试剂盒（荧光免疫层析法）（TPICS/TPICK）
                 免疫层析试纸条装置如图 1 所示。在测试线 M、                      与上海之江生物科技股份有限公司生产的新型冠
            G，质控线 C 中，M 包被有抗人 IgM 二抗；G 包被                      状病毒 COVID-19 核酸检测试剂盒（PCR 法）和广
            有抗人 IgG 二抗；C 包被有羊抗鼠 IgG（质控）。                       州万孚生物技术股份有限公司生产的新型冠状病
                 工作原理：                                         毒（COVID-19）抗体检测试剂盒（胶体金法），分
                 试纸条是基于免疫亲合原理与纸上层析（薄层                          别测定人全血、血浆、血清中的新型冠状病毒
            层析）原理建立起来的快速检测技术。                                  COVID-19。
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