Page 89 - 《精细化工》2021年第7期

第 7 期 黄池宝，等: 用于新型冠状病毒快速诊断的荧光免疫层析试纸条的制备及其细胞成像 ·1371·

1.4.3 临床标本收集及储存 1 h 后 PBS 洗涤 3 次，吹干细胞片后加荧光保护剂，
（1）本试剂盒适用血清、乙二胺四乙酸（EDTA） 放上盖玻片后封片，单、双光子显微镜下观察记录
抗凝血浆和 EDTA 抗凝全血样本，建议使用新鲜样本。 结果。
（2）血清和血浆样本在 2~8 ℃保存 7 d，全血
2 结果与讨论
样本在 2~8 ℃保存 2 d，血清、血浆和全血样本在
(–20±5) ℃冷冻保存 3 个月。避免反复冻融。 (–20±5)
2.1 LP 与 LP-Ag 的荧光与双光子激发荧光光谱
℃条件下，运输时间不得超过 7 d。
探针 LP 与荧光抗原 LP-Ag 在 PBS（1 µmol/L，
（3）检测前样本必须恢复至室温。冷冻保存的
pH 7.2）中的单光子荧光光谱及双光子激发荧光光
样本需完全融化、复温、混合均匀后方可使用。避
谱见图 2。由图 2a 可知，LP 与 LP-Ag 的单光子荧
免反复冻融。
光光谱几乎一样，差别极小，这是由于它们具有相
（4）样本可加入防腐剂（如：体积分数 1%的
同的荧光团，而荧光光谱由荧光团决定，未直接连
ProClin 300），对实验结果不会产生干扰。
接于荧光团上的基团对荧光光谱的影响甚微。其最
（5）样本中：胆红素≤0.5 g/L，血红蛋白≤
–6
大发射波长在 500 nm 处。以硫酸喹啉（1.0×10
10 g/L，乳糜≤10 g/L，不会对实验产生干扰。
mol/L, 0.05 mol/L H 2 SO 4 ）作参比测定 LP 与 LP-Ag
1.4.4 临床操作时间测定
的荧光量子产率分别为 0.61 和 0.56。由图 2b 可知，
分别测定 TPICS/TPICK、PCR 法和胶体金法 3
LP 与 LP-Ag 的最大双光子激发波长均为 750 nm，
种试剂盒检测血样所需的操作时间，每次测定取 1
相应的双光子发射截面（δΦ）分别为 124（LP）和
个试剂盒，3 种试剂盒各分别测定 5 次。
4
121 GM（LP-Ag）（1 GM=10 –50 cm ·s/光子）。
1.5 细胞培养与染色
1.5.1 SARS-CoV-2 感染绿猴肾（Vero）细胞片的制备
SARS-CoV-2 感染 Vero 细胞片的制备及灭活在
日本长崎大学热带医学研究所生物安全 3 级（P3）
实验室进行。主要操作过程如下：取新型冠状病毒
日本分离株 TY-WK-521/20202（Genebank accession
number：LC522975）接种 Vero 细胞，在质量分数
2%胎牛血清（FBS）的 Eagle 基础培养基下 37 ℃培
养 4 d。病毒感染细胞经质量分数 0.25%胰酶消化，
3
PBS（pH 7.2）洗涤 2 次，2.0×10 r/min 离心收集
细胞，悬浮于少量 PBS 中。未感染 Vero 作同样处
理。病毒感染及未感染 Vero 分别滴于 8 孔载玻片上
（MP Bio-chemicals，CA，USA），吹干细胞片，紫
外线灭活后 4 ℃预冷丙酮固定并进一步灭活处理。
1.5.2 LP 标记新型冠状病毒 N 蛋白单克隆抗体
（1）取 50 μL 新型冠状病毒 N-蛋白单克隆抗体
PBS（pH 7.2）溶液（贵州省人民医院中心实验室制
备）（0.5 g/L），加入碳酸盐缓冲液（pH 9.3）5 μL，
加入 LP 的二甲基亚砜溶液（2 g/L）15 μL，混匀，

于摇床 200 r/min，25 ℃下反应 2 h。
图 2 LP 和 LP-Ag 的 UV-Vis 吸收光谱、单光子荧光光
（2）超滤纯化，将上面液体加入超滤管（10 K，
谱（a）及双光子激发荧光光谱（b）
美国密理博 Millipore），加磷酸盐缓冲液（PBS， Fig. 2 UV-Vis absorption and one-photon fluorescence
0.02 mol/L， pH 7.2 ）到总体积 80%，然后离心 spectra (a) and two-photon (TP) exaction fluorescence
4
（1.0×10 r/min 左右，4 ℃）15 min，重复加 PBS spectra (b) of LP and LP-Ag

洗涤离心 3 次。 2.2 免疫层析试纸条的临床研究结果与分析
1.5.3 LP 标记新型冠状病毒单抗荧光染色 2.2.1 与新型冠状病毒 SARS-CoV-2 核酸检测试剂
取上述制备病毒感染及未感染细胞片，质量分 盒（PCR 法）的比较
数 3%牛血清白蛋白室温封闭 1 h，加入体积比为 1∶ 表 1 为免疫层 析试纸条与 新型冠状病 毒
200 稀释的 LP 标记新型冠状病毒单抗，37 ℃反应 SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒（PCR 法）的比较。