Page 169 - 《精细化工》2021年第9期
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第 9 期                许   哲,等:  高安全性富勒烯化妆品原料及其美白、抗炎、修复功效                                 ·1883·


                 分别称取 MHAF60 和 PPF60 各 0.1 g,置于                    细胞保护实验:将 HEK-A 细胞接种到 96 孔板
            10 mL 容量瓶中,加入去离子水 9 mL,超声 30 min,                  中,用无色 DMEM 培养液培养 24 h 后吸出,用 PBS
            使材料全部溶解,冷却后,加入去离子水至刻度,                             冲洗干净,将空白培养液和分别含有 MHAF60、水
            摇匀;上述溶液分别取 1 mL 置于 10 mL 容量瓶中,                     溶性虾青素、V C 的培养液与细胞共同孵育 3 h 后,
            用去离子水稀释至刻度,分别配制富勒烯 C 60 质量                         在浓度为 0.8 mmol/L H 2 O 2 下孵育 1 h,使用新鲜培
            浓度为 10 mg/L MHAF60 和 PPF60 水溶液;去离子                 养液培养 24 h 后,用 CCK-8 染色。
            水为空白,测定上述溶液吸光度分别为 0.754 和                              细胞修复实验:将 HEK-A 细胞接种到 96  孔板
            0.748。带入上述标准曲线方程后计算得出 MHAF60                       中,用无色 DMEM 培养液培养 24 h 后,在浓度为
            和 PPF60 材料中富勒烯 C 60 质量分数均为 1%。                     0.8 mmol/L H 2 O 2 下孵育 1 h,使用 PBS 冲洗干净后,
                 将 MHAF60 和 PPF60 分别用去离子水溶解,配                  再将含有 MHAF60、水溶性虾青素和 V C 的培养液
            制成富勒烯 C 60 质量浓度为 50 mg/L 和 HA 5 g/L  水             与细胞共同孵育 24 h 后,用 CCK-8 染色,测试细胞
            溶液(记为 MHAF60-50);富勒烯 C 60 质量浓度为                    成活数量(OD)。按照式(1)计算细胞活性:
            400 mg/L 和 HA 40 g/L 水溶液(记为 MHAF60-400);              细胞活性=(OD 样品-OD 培养基)/(OD 空白组-OD 培养基)
            富勒烯 C 60 质量浓度为 50 mg/L 和 PVP 5 g/L 水溶液             1.3.5   斑马鱼美白模型实验及测试
            (记为 PPF60-50);富勒烯 C 60 质量浓度为 400 mg/L                  根据机构动物护理和委员会协议,在(28±0.5)  ℃,
            和 PVP 40 g/L 水溶液(记为 PPF60-400)。                    夜(14 h)/昼(10 h)循环,在装有充气淡水的流
                 FTIR 表征:采用 KBr 压片法进行测试。                       通池中进行培养。
            1.3.2   气相色谱表征                                         斑马鱼交配产卵后 6 h 在显微镜下挑选发育正
                 色谱条件为色谱柱 DB-WAX(Agilent 30 m×                 常胚胎,以 6 孔板为实验容器,每孔放 20 枚胚胎,
            0.25 mm×0.5 μm);进样口 200  ℃;检测器 250  ℃;             鱼液培养的胚胎作为空白对照,MHAF60 鱼液组(富
            分流比 20∶1;载气为氮气;顶空温度 100  ℃,平衡                      勒烯 C 60 质量分数 0.002%),HA 鱼液组和 V C 鱼液
            时间5 min;升温程序为40  ℃保持20 min,以5  ℃/min               组每隔 24 h 换一次药,在 48 h 拍照。
            的速率升温至 100  ℃,保持 2 min,以 50  ℃的速率                  1.3.6   斑马鱼切尾模型实验及测试
            升温至 200  ℃,保持 5 min。                                   斑马鱼交配产卵后 6 h 在显微镜下挑选发育正
                 对照品溶液配制:将甲苯 22.25 mg 加入 50 mL                 常胚胎,以 6 孔板为实验容器,每孔放 20 枚胚胎,
            容量瓶中,用邻二氯苯稀释至刻度,摇匀,精密量                             每隔 24 h 换一次药,48 h 后对尾鳍进行切除,切尾
            取 1 mL 上述溶液至另一 50 mL 容量瓶中,加邻二                      6 h,观察鱼尾部中性粒细胞数量;切尾后处理 3 d,
            氯苯稀释至刻度,摇匀,再精密量取 10 mL 溶液置                         观察尾部再生修复情况。
            顶空进样瓶中,立即进行密封,备用。                                  1.3.7   斑马鱼刺激性模型实验及测试
                 样品溶液配制:将 MHF60-400、PPF60-400 和                    斑马鱼交配产卵后 6 h 左右在显微镜下挑选发
            市场竞品各 10 mg 分别置于顶空进样瓶中,再分别                         育正常胚胎,以 6 孔板为实验容器,每孔放 20 枚胚
            加入 10 mL 邻二氯苯,加盖密封后超声、振摇溶解                         胎,鱼液培养的胚胎作为空白对照组,原料组为 V C
                                                               组、HA 组和 MHAF60 组(富勒烯 C 60 质量分数
            后,备用。
                                                               0.002%)。每隔 24 h 换一次药,48 h 后用 1.5 mL 离
            1.3.3   电子自旋共振表征
                                                               心管收集胚胎 15 条,加入 DCFH-DA 染色 30 min
                 将 100 μL DMPO (100 mmol/L)和 100 μL H 2 O 2
            (100 mmol/L)分别与 50 μL 超纯水、MHAF60-50、               后拍照。
            PPF60-50、50 mg/L V C 水溶液和 50 mg/L  虾青素水            2    结果与讨论
            溶液混合。测试过程:将双氧水溶液(1 mmol/L)
            在 500 W 紫外光照射 4 min,然后向其中加入测试                      2.1  UV-Vis 及 FTIR 分析
            样品,在黑暗条件下记录 X 波段 EPR 光谱。                               图 1 为样品的 UV-Vis 谱图。由图 1 可见,富勒
            1.3.4  HEK-A 细胞损伤实验及测试                             烯 C 60 的吸收波长在 335 nm;PPF60 在 338 nm;
                 细胞培养:将冷冻的 HEK-A 细胞使用 37  ℃水                   MHAF60 在 340 nm。MHAF60 特征吸收峰与富勒烯
            解冻后,在 37  ℃、体积分数为 5% CO 2 条件下进行                    C 60 吸收峰的峰型相似,无明显变化,而 PPF60 呈
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            培养,定期观察,传代至 5×10 个细胞后进行实验。                         肩峰,峰型变化较大。
                 待测样品:称取 100 mg MHAF60,用 19.9 g                    通过 UV-Vis 检测发现两款水溶性富勒烯产品
            DMEM 培养基溶解,得到富勒烯 C60 质量分数为                         的吸收峰均发生了红移,但仍为富勒烯 C 60 的特征
            0.005%的 MHAF60 培养液;使用 DMEM 分别稀释                    吸收峰。由于富勒烯 C 60 被均匀分散到材料中,富
            水溶性虾青素和 V C 质量分数为 0.005%的培养液。                      勒烯 C 60 与 PVP 或 HA 形成较大电子共轭体系,电
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