Page 169 - 《精细化工》2021年第9期
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第 9 期 许 哲,等: 高安全性富勒烯化妆品原料及其美白、抗炎、修复功效 ·1883·
分别称取 MHAF60 和 PPF60 各 0.1 g,置于 细胞保护实验:将 HEK-A 细胞接种到 96 孔板
10 mL 容量瓶中,加入去离子水 9 mL,超声 30 min, 中,用无色 DMEM 培养液培养 24 h 后吸出,用 PBS
使材料全部溶解,冷却后,加入去离子水至刻度, 冲洗干净,将空白培养液和分别含有 MHAF60、水
摇匀;上述溶液分别取 1 mL 置于 10 mL 容量瓶中, 溶性虾青素、V C 的培养液与细胞共同孵育 3 h 后,
用去离子水稀释至刻度,分别配制富勒烯 C 60 质量 在浓度为 0.8 mmol/L H 2 O 2 下孵育 1 h,使用新鲜培
浓度为 10 mg/L MHAF60 和 PPF60 水溶液;去离子 养液培养 24 h 后,用 CCK-8 染色。
水为空白,测定上述溶液吸光度分别为 0.754 和 细胞修复实验:将 HEK-A 细胞接种到 96 孔板
0.748。带入上述标准曲线方程后计算得出 MHAF60 中,用无色 DMEM 培养液培养 24 h 后,在浓度为
和 PPF60 材料中富勒烯 C 60 质量分数均为 1%。 0.8 mmol/L H 2 O 2 下孵育 1 h,使用 PBS 冲洗干净后,
将 MHAF60 和 PPF60 分别用去离子水溶解,配 再将含有 MHAF60、水溶性虾青素和 V C 的培养液
制成富勒烯 C 60 质量浓度为 50 mg/L 和 HA 5 g/L 水 与细胞共同孵育 24 h 后,用 CCK-8 染色,测试细胞
溶液(记为 MHAF60-50);富勒烯 C 60 质量浓度为 成活数量(OD)。按照式(1)计算细胞活性:
400 mg/L 和 HA 40 g/L 水溶液(记为 MHAF60-400); 细胞活性=(OD 样品-OD 培养基)/(OD 空白组-OD 培养基)
富勒烯 C 60 质量浓度为 50 mg/L 和 PVP 5 g/L 水溶液 1.3.5 斑马鱼美白模型实验及测试
(记为 PPF60-50);富勒烯 C 60 质量浓度为 400 mg/L 根据机构动物护理和委员会协议,在(28±0.5) ℃,
和 PVP 40 g/L 水溶液(记为 PPF60-400)。 夜(14 h)/昼(10 h)循环,在装有充气淡水的流
FTIR 表征:采用 KBr 压片法进行测试。 通池中进行培养。
1.3.2 气相色谱表征 斑马鱼交配产卵后 6 h 在显微镜下挑选发育正
色谱条件为色谱柱 DB-WAX(Agilent 30 m× 常胚胎,以 6 孔板为实验容器,每孔放 20 枚胚胎,
0.25 mm×0.5 μm);进样口 200 ℃;检测器 250 ℃; 鱼液培养的胚胎作为空白对照,MHAF60 鱼液组(富
分流比 20∶1;载气为氮气;顶空温度 100 ℃,平衡 勒烯 C 60 质量分数 0.002%),HA 鱼液组和 V C 鱼液
时间5 min;升温程序为40 ℃保持20 min,以5 ℃/min 组每隔 24 h 换一次药,在 48 h 拍照。
的速率升温至 100 ℃,保持 2 min,以 50 ℃的速率 1.3.6 斑马鱼切尾模型实验及测试
升温至 200 ℃,保持 5 min。 斑马鱼交配产卵后 6 h 在显微镜下挑选发育正
对照品溶液配制:将甲苯 22.25 mg 加入 50 mL 常胚胎,以 6 孔板为实验容器,每孔放 20 枚胚胎,
容量瓶中,用邻二氯苯稀释至刻度,摇匀,精密量 每隔 24 h 换一次药,48 h 后对尾鳍进行切除,切尾
取 1 mL 上述溶液至另一 50 mL 容量瓶中,加邻二 6 h,观察鱼尾部中性粒细胞数量;切尾后处理 3 d,
氯苯稀释至刻度,摇匀,再精密量取 10 mL 溶液置 观察尾部再生修复情况。
顶空进样瓶中,立即进行密封,备用。 1.3.7 斑马鱼刺激性模型实验及测试
样品溶液配制:将 MHF60-400、PPF60-400 和 斑马鱼交配产卵后 6 h 左右在显微镜下挑选发
市场竞品各 10 mg 分别置于顶空进样瓶中,再分别 育正常胚胎,以 6 孔板为实验容器,每孔放 20 枚胚
加入 10 mL 邻二氯苯,加盖密封后超声、振摇溶解 胎,鱼液培养的胚胎作为空白对照组,原料组为 V C
组、HA 组和 MHAF60 组(富勒烯 C 60 质量分数
后,备用。
0.002%)。每隔 24 h 换一次药,48 h 后用 1.5 mL 离
1.3.3 电子自旋共振表征
心管收集胚胎 15 条,加入 DCFH-DA 染色 30 min
将 100 μL DMPO (100 mmol/L)和 100 μL H 2 O 2
(100 mmol/L)分别与 50 μL 超纯水、MHAF60-50、 后拍照。
PPF60-50、50 mg/L V C 水溶液和 50 mg/L 虾青素水 2 结果与讨论
溶液混合。测试过程:将双氧水溶液(1 mmol/L)
在 500 W 紫外光照射 4 min,然后向其中加入测试 2.1 UV-Vis 及 FTIR 分析
样品,在黑暗条件下记录 X 波段 EPR 光谱。 图 1 为样品的 UV-Vis 谱图。由图 1 可见,富勒
1.3.4 HEK-A 细胞损伤实验及测试 烯 C 60 的吸收波长在 335 nm;PPF60 在 338 nm;
细胞培养:将冷冻的 HEK-A 细胞使用 37 ℃水 MHAF60 在 340 nm。MHAF60 特征吸收峰与富勒烯
解冻后,在 37 ℃、体积分数为 5% CO 2 条件下进行 C 60 吸收峰的峰型相似,无明显变化,而 PPF60 呈
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培养,定期观察,传代至 5×10 个细胞后进行实验。 肩峰,峰型变化较大。
待测样品:称取 100 mg MHAF60,用 19.9 g 通过 UV-Vis 检测发现两款水溶性富勒烯产品
DMEM 培养基溶解,得到富勒烯 C60 质量分数为 的吸收峰均发生了红移,但仍为富勒烯 C 60 的特征
0.005%的 MHAF60 培养液;使用 DMEM 分别稀释 吸收峰。由于富勒烯 C 60 被均匀分散到材料中,富
水溶性虾青素和 V C 质量分数为 0.005%的培养液。 勒烯 C 60 与 PVP 或 HA 形成较大电子共轭体系,电