Page 87 - 《精细化工》2021年第9期
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第 9 期               海国冉，等:  构建 pH 响应性中空介孔硅纳米复合材料用于肿瘤联合治疗                                ·1801·


            12 mL  PBS（pH 7.4,  10 mmol/L）缓冲液中，加入              （pH 5.0）试管中，并将试管放入 37  ℃摇床振荡。
            30 mg（0.517 mmol）DOX，30 mg（0.154 mmol）             在预定的时间间隔内取出 1 mL  PBS，并补加 1 mL
            PEG-R 7 -RGDS，室温下避光搅拌 48 h。反应结束后，                  相应的 PBS。取 1 mL 的 DOX/MnO 2 @HMSN-imide-
            离心（12000 r/min，10 min），收集沉淀。分别先后                   PEG-R 7 -RGDS（0.3 g/L）完全沉浸于 PBS（pH 7.4）
            用超纯水和无水甲醇洗涤沉淀 3 次，最后室温下真                           试管中作为对照组。随后利用荧光分光光度计测定
            空 干 燥得到 DOX/MnO 2 @HMSN-imide-PEG-R 7 -            取出外液的 DOX 荧光强度，并根据 DOX 的标准曲
            RGDS 纳米复合颗粒。                                       线计算得到 DOX 的体外累积释药量。
            1.3    结构表征与性能测试                                   1.3.7   体外产生 ROS 的检测
            1.3.1   靶向多肽 PEG-R 7 -RGDS 的结构表征                       利用活性氧物种（ROS）指示剂 2′,7′-二氯荧光
                 将 PEG-R 7 -RGDS 分散在超纯水中，配制质量                  素二乙酸酯（DCFH-DA）  检测混合溶液中 ROS 的
            浓度为 5 g/L 的溶液，利用质谱仪检测该多肽的相                         产生。配制 1 mL 含不同浓度（0、0.5、1、10 mmol/L）
            对分子质量。                                             GSH，8 mmol/L H 2O 2 和 0.05 g/L DOX/MnO 2@HMSN-
            1.3.2  TEM 表征                                      imide-PEG-R 7 -RGDS 和 NaHCO 3 （25 mmol/L）的
                 分别将质量浓度为 0.05 g/L 的 DOX/MnO 2 @               PBS 缓冲液中，将其置于 37  ℃摇床中振荡 30 min。
            HMSN-imide-PEG-R 7 -RGDS 溶液和 HMSN 溶液滴              以含有 DOX/MnO 2 @HMSN-imide-PEG-R 7 -RGDS 和
            在超薄碳支持膜上。待液滴自然干燥后，通过透射                             自由 RGDS 多肽（2  μmol/L）的溶液作为对照组。
            电子显微镜观察纳米颗粒的形貌。                                    随后加入 DCFH-DA（10 μL，20 mmol/L），并通过
            1.3.3   傅里叶变换红外光谱表征                                荧光分光光度计测定每组溶液中 2′,7′-二氯荧光素
                 分别取少量的 HMSN/CTAB，HMSN 和 DOX/                  （DCF）的荧光强度（激发波长为 488 nm，发射波
            MnO 2 @HMSN-imide-PEG-R 7 -RGDS 粉末与纯 KBr           长为 525 nm）。
            粉末混合均匀，充分研磨后压制成薄膜，通过傅里                             1.3.8   细胞培养
            叶变换红外光谱仪测定纳米粒子的红外光谱。                                   选择人宫颈癌细胞（HeLa）和非洲绿猴肾细胞
            1.3.4  DOX 荧光标准曲线、载药率及载药量的测定                       （COS 7）在 DMEM 培养基〔含有质量分数为 1%
                 配制一系列浓度梯度的 DOX 溶液，使用荧光                        的双抗（青霉素-链霉素,  青霉素：10000 units/mL，
            分光光度计检测 DOX 的荧光发射光谱，制出 DOX                         链霉素：10000 mg/L）和质量分数为 10%的灭活胎
            的标准曲线。                                             牛血清〕中培养。培养环境为 37 ℃，含体积分数为
                 将 0.3 mg 的 DOX/MnO 2 @HMSN-imide-PEG-         5%的 CO 2 。
            R 7 -RGDS 加入 100 μL 氢氟酸刻蚀，测量溶液的荧光                  1.3.9   细胞内吞
            强度（激发波长为 488 nm，入射狭缝宽度和出射狭                             将 HeLa 细胞和 COS 7 细胞接种于共聚焦培养
            缝宽度均为 5 nm），根据标准曲线确定材料中 DOX                        皿，放入培养箱中培养 24 h。随后分别加入含有
            的载药量。                                              DOX/MnO 2@HMSN-imide-PEG-R 7-RGDS（40 mg/L）
            1.3.5   电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）                         和 DOX（13 mg/L）的 DMEM 溶液，继续培养 4 h。
                         2+
                 使用 Mn 标准溶液配制一系列浓度梯度的                          用 PBS 洗涤培养皿 3 次，随后加入 1 mL PBS，使用
                                          2+
               2+
            Mn 溶液，利用 ICP-MS 检测 Mn 溶液所对应的每                      共聚焦显微镜〔激发波长 488 nm，接收通道（525 ±
                                    2+
            秒计数值（CPS），作出 Mn 的标准曲线（等离子体                         10）nm〕观测细胞内 DOX 的荧光强度和分布情况。
            流量 15.0 L/min、辅助气流量 0.2 L/min、雾化器流                 1.3.10   细胞内产生 ROS 的检测
            量 0.8 L/min 、 射 频功率 1300 W 、试样 流量                      将 HeLa 细胞和 COS 7 细胞接种于共聚焦培养
            1.5 mL/min）。                                       皿中，放入培养箱中培养 24 h 后，加入含有
                 将 0.3 mg  DOX/MnO 2 @HMSN-imide-PEG-R 7 -     DOX/MnO 2@HMSN-imide-PEG-R 7-RGDS（40 mg/L）
            RGDS 加入 500 μL 硝酸硝化过夜，加水稀释至 Mn               2+    的 DMEM 溶液培养 4 h 后，加入已配制好的
            标准曲线的浓度范围，测量 CPS 值。随后将测得的                          DCFH-DA，使 DCFH-DA 在培养皿内的最终浓度为
                         2+
            CPS 代入 Mn 的标准曲线方程，得到样品溶液中                          20 μmol/L。继续培养 30 min 后，用 PBS  洗涤 3 次
               2+
            Mn 的浓度，进而计算得到材料中 MnO 2 的负载量。                       培养皿，随后加入 1 mL PBS，并使用共聚焦显微镜
            1.3.6  DOX 体外释药实验                                  观测细胞中有无绿色荧光〔激发波长 488 nm，接收
                 取 1 mL DOX/MnO 2 @HMSN-imide-PEG-R 7 -        通道（525 ± 10）nm〕。
            RGDS 溶液（0.3 g/L），加入 3500 Da 的透析袋中。                 1.3.11   细胞毒性测试
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            随后将透析袋完全浸入装有 10 mmol/L GSH 的 PBS                       首先在 96 孔板中以 1×10 个的细胞密度接种
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