Page 177 - 《精细化工》2022年第12期
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第 12 期                    王思念，等:  马铃薯/乳清蛋白复合凝胶的性质和微观结构                                  ·2543·


            双频超声设备中处理。超声条件参考 MAO 等                    [13] 设   1.3.4   凝胶质构测定
            定为：超声频率 40/60 kHz，超声时间 7.5 min，超                       参考王耀松等      [15] 的方法并适当修改。实验参数：
            声功率为 240 W，超声脉冲和间歇时间分别为 10 s 和                     选择质地多面剖析法（TPA）测定凝胶样品质构，
            2 s。样品超声结束后，取出，在 pH=12.0 继续偏移                      探头型号为 P/0.5，测前和测后速度均为 1.0 mm/s，
            52.5 min，偏移结束后用 1 mol/L HCl 将马铃薯蛋白                 形变比例为 30%，触发力为 2 g。
            溶液 pH 调至 7.0，得到改性马铃薯蛋白溶液。                          1.3.5   凝胶水分分布测定
                 称取一定量乳清蛋白（通过凯氏定氮仪测定蛋                              参考 XIAO 等   [16] 的方法，用低场核磁（LF-NMR）
            白质量分数为 90.9%）溶于改性马铃薯蛋白溶液中，                         测定凝胶中水分的分布。具体参数参考仪器说明书，
            使得复合蛋白溶液中乳清蛋白与马铃薯蛋白质量比                             设置如下：选择 60 mm 探头，序列名称 QFID，采
            为 1∶1，总蛋白质量浓度分别为 40、50、60、70、                      样频率 200 kHz，测量温度 25  ℃，等待时间（T w ）
            80 g/L，磁力搅拌 1 h 后，备用。鉴于乳清蛋白最低                      为 1500 ms，射频延时（RFD）为 0.002 ms，数字增
            成胶质量浓度为 80 g/L       [8-10] ，选择 80 g/L 为总蛋白        益（DRG1）为 3，重复采样次数为 4。将得到的 CPMG
            质量浓度上限，探讨不同总蛋白质量浓度对凝胶性                             （Carr-Purcell-Meiboom-Gill）指数衰减曲线用仪器
            质的影响。蛋白质量浓度下限选择 40 g/L，是由于                         自带的 Multi Exp Inv Analysis 软件进行反演。
            总蛋白质量浓度低于 40 g/L 时，复合蛋白溶液已经                        1.3.6   凝胶中蛋白分子间作用力测定
            不能形成固体凝胶。                                              维持蛋白凝胶分子间的作用力是通过凝胶在不
            1.2.3   复合蛋白凝胶的制备                                  同溶剂中的溶解度来反映的。因为这些溶剂可以分
                 参考 HE 等   [14] 的方法，称取 5 g 总蛋白质量浓              别破坏凝胶中蛋白分子间的疏水相互作用，如氢键
            度不同的复合蛋白溶液，置于 10 mL 烧杯中，用锡                         和二硫键，从而使蛋白分子重新溶解，溶解度的大
            纸封口，90  ℃水浴加热 30 min，取出用冰水快速冷                      小则反映了分子间作用力的大小。参考 JIANG 等                  [17]
            却至室温，并放入 4  ℃冰箱冷藏过夜（20 h），第 2 d                    的方法并适当修改。分别取 1 g 捣碎的凝胶样品与
            取出凝胶恢复至室温后使用。得到的凝胶样品用于                             9 mL  3 种不同溶剂〔含 8 mol/L 尿素的 50 mmol/L
            后续质构、水分分布、分子间作用力、激光共聚焦                             磷酸盐缓冲液（pH=7.0）、含 5 g/L SDS 的磷酸盐缓冲
            显微镜以及扫描电子显微镜的测试。                                   液（50 mmol/L，pH=7.0）、含体积分数 0.25% -巯基
            1.3   结构表征与性能测定                                    乙醇的磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.0）〕混合，
            1.3.1   复合蛋白溶液粒径和电位的测定                             于 80  ℃加热 30 min，冷却至室温后离心（5000 g、
                 参考 MAO 等    [13] 方法用粒度电位仪测量复合蛋                15 min）取上清液，用双缩脲法            [18] 测定上清液中蛋
            白溶液的粒径和电位。参数设置：温度 25  ℃，平                          白含量（g/L），计算蛋白溶解度。
            衡时间 1 min；粒径测定采用可抛弃样品池，材料折                         溶解度/%=（溶解的蛋白含量/凝胶中总蛋白含量）×100
            射率为 1.45，溶剂折射率为 1.33；电位测定采用                        1.3.7   激光共聚焦电子显微镜（CLSM）测试
                                                                                               3
            Omega 样品池，溶剂折射率为 1.33。                                 将制备好的蛋白凝胶切成 1 cm 小块，置于体
            1.3.2   流变特性测定                                     积分数 2.5%的戊二醛/磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L，
                 参考 MAO 等    [13] 的方法，采用直径为 40 mm 的            pH=7.0）中固定 4 h。取出用冷冻切片机将样品切成
            平板进行流变性分析，上样为复合蛋白溶液。流变                             50  μm 厚度的薄片置于载玻片上，用 Fast Green
            性分析的工作间距设置为 1 mm。在样品周围添加适                          （10 g/L）染色后盖上盖玻片，置于激光共聚焦显微镜
            量硅油防止样品水分蒸发。温度扫描条件：设置温                             观察复合蛋白凝胶的微观结构。Fast Green 的激发波长
            度循环过程应变和频率分别为 0.5%和 1 Hz，以 5  ℃                    设定为 633 nm。
            /min 速率从 25  ℃升温到 90  ℃，保温 30 min 后以               1.3.8  SEM 测试
            同样速率降温至 25  ℃，在 25  ℃保温 10 min。结束                      将经过戊二醛固定的凝胶样品用导电胶固定在
            后，凝胶样品在 25  ℃下进行频率扫描，频率范围                          金属导电台上，喷金后置于 SEM 台面上，在 15 kV
            0.1~10 Hz。频率扫描结束后在温度 25  ℃、频率 1 Hz、                的电压下进行微观结构观察。
            应变 0.1%~50%范围进行应变扫描。                               1.3.9  FTIR 测试
            1.3.3   凝胶色度测定                                         参考 LIU 等   [19] 的方法，利用红外光谱仪收集冷
                 参考 HE 等   [14] 的方法测定复合凝胶色度。用色                 冻干燥凝胶样品的红外谱图。参数设定为：波数范
                                                                             −1
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            差仪在凝胶表面上随机进行测量，得到亮度（L ）、                           围 4000~400 cm 、扫描次数 32 次。数据分析采用
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                      *
            红/绿值（a ）、蓝/黄值（b ）。每个样品取 3 个不同                      OMNIC 和 Peakfit 软件处理，根据子峰和各类二级结
            位置进行分析。                                            构位置的对应关系，计算蛋白各二级结构的百分含量。
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