Page 68 - 《精细化工》2022年第3期
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·490·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 39 卷

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            为紫色固体 P-3O。对产物进行 HNMR、 CNMR                        养基作为对照组，在 37 ℃下静置 1 h 后通过 DLS
            表征和相对分子质量表征。相对分子质量表征方法                             测量粒径变化。
            如下：将 P-3O 溶于色谱级 DMF（质量浓度 2 g/L），                       稀释稳定性：使用含有体积分数为 10%胎牛血
            通过流动相为色谱级 DMF（含有质量分数为 0.1%                         清的细胞培养基将初始质量浓度为 0.5 g/L 的纳米
            的溴化锂）、流速为 1 mL/min 且柱温为 45  ℃的凝                    粒溶液分别稀释 5、10、20、50 和 100 倍，配制成
            胶渗透色谱仪（GPC）测定聚卟啉的数均相对分子                            质量浓度分别为 0.1、0.05、0.025、0.01 和 0.005 g/L
            质量、重均相对分子质量以及分散性指数。                                溶液，在 37 ℃下静置 1 h 后通过 DLS 测量粒径变化。
                 将单体换成二乙二醇或六甘醇可对应得到                                冻干稳定性：取上述纳米粒母液稀释至 pH 为
            P-1O 与 P-5O。                                       7.16 的 PBS 溶液中，终质量浓度为 0.5 g/L，通过
            1.3   单线态氧产率计算                                     DLS 分别测量其在40  ℃冻干前后的粒径。
                 使用 1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）测量 P-1O、                     时间稳定性：取上述纳米粒母液稀释至 pH 为
            P-3O 或 P-5O 的单线态氧产率。DPBF 是常见的检                     7.16 的 PBS 溶液中，终质量浓度为 0.5 g/L，并保存
            测单线态氧产率的探针，DPBF 在 420 nm 处有明显                      于室温下，分别在第 1、2、3 d 通过 DLS 测量粒径。
            的紫外吸收峰，通过最初的[4+2]环加成反应与单线                              粒径稳定性用 T 检验进行双侧显著性差异分
            态氧反应生成环加合物，该环加合物不稳定，会分                             析。ns 代表无显著性差异，*p<0.05 表示具有统计
            解成 1,2-二苯甲酰基苯。在此过程中可以观察到                           学差异， **p<0.01 表示具有显著统 计学差异，
            DPBF 的紫外吸收峰强度降低，通过 UV-Vis 光谱监                      ***p<0.001 表示具极其显著的统计学差异。
            测此过程。将 DPBF 及光敏剂（TCPP、P-1O、P-3O                    1.5   聚卟啉的体外光暗毒性评价
            或 P-5O）溶解在 DMSO 中，分别配制成 DPBF 溶液                        采用 MTT 法测定 P-5O 纳米粒对小鼠肝癌细胞
                    –5
                                                 –6
            （2× 10  mol/L）与光敏剂浓度为 2×10  mol/L 的                （Hep1-6）以及人肾上皮细胞（293T）的细胞毒
                                                                                        4
            TCPP 或聚卟啉（P-1O、P-3O 或 P-5O）溶液，将上                   性 [34-35] 。将两种细胞以 1×10 个细胞/孔的密度接种
            述两种溶液分别取 1.5 mL 混合。激光灯参数设置为                        在 96 孔板中，使用含体积分数为 10% FBS 的 DMEM
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            波长 650 nm、光斑密度为 20 mW/cm 。将混合溶液                    培养基培养。按照 1.4 节所述母液配制方法配制浓
            用光照射，每隔一定时间记录其在 420 nm 的紫外吸                        度为 50 μmol/L 的纳米粒溶液，并将其加入 Hep1-6
            光度。单线态氧产率（Φ Δ ）的计算公式如下：                            或 239T 细胞中。培养 4 h 后，用 650 nm  激光（激
                                                                                     2
                                     Std
                             Std
                                           Std
                       Φ Δ  = Φ Δ  × R × I  / (R  × I)         光功率密度为 10 mW/cm ）照射孔板 30 min，继续
                    Std
            式中：Φ Δ 是 TCPP 的单线态氧产率；R 和 R             Std  分别    将细胞孵育 20 h 后，使用 MTT 方法对其光毒性进
            代表存在聚卟啉（P-1O、P-3O 或 P-5O）和 TCPP                    行测定。移除光毒性测定实验步骤中的光照部分，
            的情况下 DPBF 在 420 nm 处的紫外吸光度变化与照                     即为暗毒性的测定方法；移除光毒性测定实验步骤
            射时间的关系曲线的斜率；I             Std  和 I 分别代表 TCPP       中的加入纳米粒的步骤，即为仅光照组的测定方法；
            和聚卟啉（P-1O、P-3O 或 P-5O）的紫外吸光度。                      移除光毒性测定实验步骤中的加入纳米粒以及光照
            单线态氧产率结果为重复测试 3 次后的平均值。                            的步骤，即为空白对照组的测定方法。体外光暗毒
            1.4   纳米粒的制备、表征以及稳定性研究                             性评价的结果用 T 检验进行双侧显著性差异分析。
                 将 P-5O 直接溶于去离子水中制成质量浓度为
            5 g/L 的母液，在 37  ℃下静置 1 h，由于 P-5O 的两                2   结果与讨论
            亲性会在水溶液中自发自组装成纳米粒，将该纳米                             2.1   聚合反应条件优化
            粒水溶液直接用于后续研究，不需要进一步分离。                                 使用 TCPP 和 3O-2OH 制备 P-3O 为初始聚合模
            纯水中的粒径大小用动态光散射仪（DLS）测量。                            板反应，对聚合条件进行筛选              [36-37] 。
                 pH 稳定性：取上述纳米粒母液稀释至具有不同                            为探究溶剂对聚合反应的影响，筛选了 5 种不
            pH（pH=5.53、7.16、8.33）的 PBS 缓冲液中，终质                 同的溶剂，结果如表 1 所示。使用三氯甲烷、甲苯
            量浓度为 0.5 g/L，在 37  ℃下静置 1 h 后，通过 DLS               和乙腈为反应溶剂时，P-3O 的产率较低且重均相对
            测量粒径。                                              分子质量（M w ）均低于 5000。这可能是由于 TCPP
                 血清稳定性：取上述纳米粒母液稀释至含有体                          在这些溶剂中的溶解性较差所致。相比之下，当以
            积分数为 10% FBS 的细胞培养基（DMEM 培养基）                      四氢呋喃或 DMF 为溶剂时，TCPP 单体的溶解性很
            中，终质量浓度为 0.5 g/L，以去离子水或 pH 为 7.16                  好，其中 DMF 溶剂具有最佳的产率及重均相对分子
            的 PBS 代替上述含有体积分数为 10% FBS 的细胞培                     质量。综合考虑，选用 DMF 作为反应溶剂。
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