Page 111 - 《精细化工》2023年第1期

第 1 期 陈丽楠，等: 响应面法优化板栗苞中抑制痢疾杆菌活性成分的提取工艺 ·103·

于–80 ℃冰箱冷冻储存。 具体步骤为：精确称取 1.00 mg 没食子酸，并加入
1.2.2 板栗苞抑菌成分的提取 到无水乙醇中，配成质量浓度为 10 μg/mL 的没食子
采用溶剂提取法 [20] 提取板栗苞抑菌成分。具体 酸储备液；分别取 10、20、40、60、80、100 μL
步骤为：精确称取板栗苞粉末 10.0 g，以料液比 1∶ 没食子酸储备液于 96 孔板中，用去离子水定容至
20（g∶mL），提取温度 50 ℃，分别使用水、无水 120 μL，加入 0.5 mol/L 的福林酚试剂 20 μL，放置
乙醇、体积 分数 50% 乙醇水溶液 为溶剂提取 10 min，加入 60 μL 的 Na 2 CO 3 水溶液（质量浓度为
120 min，提取液在 7500 r/min 下离心 10 min，过滤， 100 g/L），20 ℃避光放置 2 h；在 765 nm 处测定溶
旋转蒸发（48 ℃），真空干燥（50 ℃）12 h，得到 液的吸光度值，没食子酸的标准曲线方程为：y=
2
粉末状板栗苞水提物（CW）、板栗苞醇提物（CC）、 0.0461x +0.0141（R =0.999），样品的多酚含量按式
板栗苞 50%乙醇水提物（CCW）。并采用吸光光度 （1）计算，结果以没食子酸质量的平均值（mg
法测定 3 种提取物对痢疾杆菌生长曲线的影响。 GA/g）表示：
1.2.3 单因素实验  
VN
W   1000 （1）
称取 5.0 g 板栗苞样品，固定料液比为 1∶20 M
（g∶mL），提取温度 50 ℃，在不同乙醇体积分数 式中：W 代表每克干重提取物的没食子酸质量，mg
（20%、40%、50%、60%、80%）下提取 120 min， GA/g；  代表没食子酸质量浓度，μg/mL；V 代表
研究乙醇体积分数对板栗苞提取物抗菌活性的影响。 原料液的体积，mL；M 代表取样量，g；N 代表稀
称取 5.0 g 板栗苞样品，固定乙醇体积分数为 释倍数。
50%，提取温度 50 ℃，在不同料液比（1∶10、1∶ 总黄酮含量用 NaNO 2 -Al(NO 3 ) 3 法 [22] 测定。首先
15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL）下提取 120 min， 配制质量浓度为 0.2 g/L 的芦丁标准水溶液，在 10
研究料液比对板栗苞提取物抗菌活性的影响。 mL 容量瓶中分别加入 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL
称取 5.0 g 板栗苞样品，固定乙醇体积分数为 标准液，加入蒸馏水定容至 5 mL，再加入 0.3 mL
50%，料液比 1∶20（g∶mL），在不同浸提温度（30、 质量分数为 5% NaNO 2 水溶液静置 6 min，加入 0.3
40、50、60、70 ℃）下提取 120 min，研究提取温 mL 质量分数为 5% Al(OH) 3 水溶液于容量瓶中，混
度对板栗苞提取物抗菌活性的影响。 匀，室温下放置 6 min，再加入 4.4 mL 质量分数为
1.2.4 响应面实验 5%的 NaOH 水溶液，混匀静置 12 min，在 510 nm
根据单因素实验结果，选取乙醇体积分数（A）、 处测定溶液的吸光度值。芦丁的标准曲线方程为
2
料液比（B）、提取温度（C）为考察因素，以抑菌 y=0.0101x+0.348（R =0.999），样品的黄酮含量按式
率为响应值，采用响应面法进行 Box-Behnken 响应 （2）计算，结果以芦丁质量的平均值（mg rutin/g）
面实验，用 Design Expert 8.0.6 进行数据分析，进而 表示：
优化板栗苞抑菌物质提取的工艺条件。响应面实验 ρ V    N
w  （2）
因素与水平设计结果见表 1。 M  1000
式中：w 代表每克干重提取物的芦丁质量，mg
表 1 响应面实验因素与水平 rutin/g；ρ′代表芦丁质量浓度，g/L；V′代表原料液的
Table 1 Factors and levels of response surface test
体积，mL；M′代表取样量，g；N′代表稀释倍数。
因素
水平 1.2.7 最小抑菌质量浓度（MIC）的测定
A 乙醇体积分数/% B 料液比/(g∶mL) C 提取温度/℃ [23]
采用二倍稀释法 测定板栗苞各提取物的 MIC
–1 40 1∶15 40
值。将板栗苞各提取物溶于 DMSO 水溶液（DMSO
0 50 1∶20 50
体积分数 3%的水溶液），得到质量浓度为 6.4 g/L 溶
1 60 1∶25 60
液，然后依次稀释至 3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 g/L。
1.2.5 板栗苞提取物分离 将制备好的溶液（100 μL）与液体 LB 琼脂培养基
在最佳提取工艺条件下得到板栗苞提取物 （50 μL）混合，加入 OD 600 值为 0.1 的痢疾杆菌菌
（CE），将 200 g 板栗苞提取物在蒸馏水中溶解，依 悬液（50 μL），使样品最终质量浓度分别为 3.2、1.6、
次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，得到水 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 g/L。以无菌水为空白对照
相（CEW）、石油醚相（CES）、乙酸乙酯相（CEY） （CK），DMSO（1.5%）（即 DMSO 体积分数 1.5%
和正丁醇相（CED）萃取物。 的水溶液）为阴性对照，0.01 g/L 的环丙沙星为阳性
1.2.6 总酚和总黄酮含量的测定 对照。接种后，分别在 37 ℃孵育 15 h。检查其生长
总酚含量根据福林酚法 [21] 测定，并稍作修改。 情况，MIC 为无细菌生长的最低样品质量浓度。