Page 141 - 《精细化工》2023年第12期
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第 12 期                  肖志伟，等:  枯草芽孢杆菌发酵甘草渣产 2,3-丁二醇和乙偶姻                                ·2683·


                 2,3-butanediol; bioengineering


                 利用木质纤维素发酵生产生物基化学品已成为                          1   实验部分
                                          [1]
            生物质资源利用的有效途径之一 。然而，木质纤
            维素的复杂致密结构，导致其有效成分难以被酶和                             1.1   材料、试剂与仪器
                                                                                 ®
            微生物直接利用        [2-3] ，因此，木质纤维素预处理成为                    纤维素酶 Cellic  CTec2（157 FPU/mL），上海
                               [4]
            其高值化利用的关键 。                                        西格玛奥德里奇贸易有限公司；乙醇胺、冰醋酸，
                 甘草渣是甘草提取活性成分后的剩余物，富含                          AR，国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸、木糖、
            木质纤维素      [5-6] ，其中纤维素成分可通过糖化发酵转                  葡萄糖，AR，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
                              [7]
            化为生物基化学品 。研究发现，Na 2 CO 3 溶液和                       NaOH、Na 2 CO 3 、KH 2 PO 4 、MnSO 4 •H 2 O、柠檬酸三
            NaOH 溶液可有效去除甘草渣中的木质素。ERABI                         钠，AR，天津市大茂化学试剂厂；酵母浸粉、玉米
              [8]
            等 利用 0.5 mol/L Na 2 CO 3 溶液在 120  ℃、固液比            浆干粉，BR，北京奥博星生物技术有限公司。EOAA
            〔即每克甘草渣预处理所加入溶剂体积（mL），下                            按照文献[18]通过酸碱中和法制备。
            同〕1∶20 条件下预处理甘草渣 3 h，可去除 70%的                          甘草渣由新疆隆惠源药业有限公司提供，将甘草
                                     [9]
            木质素；KOORAVAND 等 在 28  ℃、固液比 1∶                     渣原料洗涤、烘干（105  ℃）、粉碎并过 40 目筛，备
            20 条件下，利用质量分数 4%的 NaOH 溶液预处理                       用，经检测其主要成分（均为质量分数）为纤维素
            甘草渣 24 h，木质素去除率达到 68%；在固液比 1∶                      33.9%、半纤维素 11.3%、木质素 37.5%、灰分 1.7%，
                                                                                                       [5]
            20、纤维素酶用量 20 FPU/g 生物质条件下，经 96 h 酶                 还包括少量的多糖、黄酮、氨基酸等其他成分 。菌
            解葡萄糖得率达 93.7%。但该法碱溶液浓度高、固                          种与培养基：甘草渣酶解液发酵使用的菌株是枯草芽
            体负载量低、预处理时间长，而且后续酶解糖化过                             孢杆菌 Bacillus subtilis (CGMCC No. 23179) [12] 。
            程中酶量较大、酶解时间长、固体负载低，导致酶                                 实验组（发酵）培养基：15 mL 甘草渣酶解液、
            解液葡萄糖浓度偏低。因此，可通过降低碱溶液浓                             质量浓度 3.5 g/L 酵母浸粉、质量浓度 6 g/L 玉米浆干
            度、缩短预处理时间、提高固体负载量等措施进一                             粉、质量浓度 3 g/L KH 2 PO 4 、质量浓度 0.065 g/L
            步优化甘草渣的预处理条件，提高预处理效率。                              MnSO 4 •H 2 O，pH=6.5。
                 离子液体是一种绿色溶剂           [10] ，在溶解木质纤维               对照组培养基：糖液 15 mL〔用 0.05 mol/L 柠檬
            素各组分方面具有高选择性             [11] 。本课题组前期对羟            酸钠缓冲液（pH=4.8）配制，葡萄糖和木糖的质量浓
            胺型离子液体的理化性质、预处理效率、对微生物                             度与甘草渣酶解液中糖浓度相同〕、质量浓度 3.5 g/L
                                                               酵母浸粉、质量浓度 6 g/L 玉米浆干粉、质量浓度 3 g/L
            的生长代谢影响等进行了研究，发现醋酸乙醇胺离
                                                               KH 2PO 4、质量浓度 0.065 g/L MnSO 4•H 2O，pH=6.5。
            子液体（EOAA）预处理效果最佳，且有良好的耐
            水性，不过成本及预处理温度较高                 [12-13] 。这类耐水          HZQ-F160 振荡培养箱，中国科学院武汉仪器厂；
                                                               Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司；
            性好的离子液体可与稀碱组成混合溶剂，降低离子
                                                               GC 2010 气相色谱仪，日本岛津公司；722 紫外-可见光
            液体黏度，而且预处理木质纤维素时可提高溶解生
            物质的能力      [14-15] 。                               分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；DF-101S
                                                               集热式恒温加热磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有
                 目前，利用甘草渣为原料生产生物基化学品的                          限公司；SHB-ⅢA 循环水式多用真空泵，上海沪析实
            研究较少     [7-9] 。利用甘草渣水解液进行大肠杆菌产琥                   业有限公司；SS-325 高温灭菌锅，日本 TOMY 公司。
                [7]
            珀酸 和酵母产乙醇          [8-9] 的研究表明，甘草渣水解液
                                                               1.2   实验方法
            可被微生物利用，但未进一步考察甘草渣水解液中
                                                               1.2.1   甘草渣预处理
            其他成分对微生物生长和代谢的影响。基于此，本
                                                                   将 5.0 g EOAA 与不同种类及浓度的稀碱溶液
            文以 C4 平台化合物 2,3-丁二醇和乙偶姻             [16-17] 为目标    （A 1 ：浓度为 0.5 mol/L 的 Na 2 CO 3 水溶液；B 1 ：浓
            产品，以稀碱（Na 2 CO 3 水溶液或 NaOH 水溶液）和                   度为 1 mol/L 的 Na 2 CO 3 水溶液；C 1 ：质量分数为 1%
            EOAA-稀碱混合溶液为溶剂，在较低温度、较短时                           的 NaOH 水溶液；D 1：质量分数为 2%的 NaOH 水溶
            间内对甘草渣进行预处理，考察预处理对甘草渣组                             液）按质量比 1∶1 混合，配成 EOAA-稀碱溶液（A 2：
            成和酶解糖化的影响，并以酶解液为碳源，利用枯                             EOAA-0.5 mol/L Na 2CO 3 水溶液；B 2：EOAA-1 mol/L
            草芽孢杆菌发酵生产 2,3-丁二醇和乙偶姻，通过与                          Na 2 CO 3 水溶液；C 2 ：EOAA-质量分数 1%的 NaOH
            模拟液发酵比较，考察甘草渣酶解液其余成分对菌                             水溶液；D 2 ：EOAA-质量分数 2%的 NaOH 水溶液）。
            体生长和产物组成生成的影响。                                         室温下，将 1.0 g 甘草渣按固液比 1∶10（g∶
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