Page 70 - 《精细化工》2023年第2期
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·292· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷
w 1.2.4.3 大孔树脂 AB-8 吸附法
r / % f 100 （2）
s w a 使用体积分数为 95%的乙醇水溶液浸泡大孔树
式中：w s 为 BSP-A 总糖质量分数，%；ρ 为用吸光 脂 AB-8 8 h，用蒸馏水洗至无醇味。取质量浓度为
度代入到无水葡萄糖标准曲线后，计算得到的 10 g/L 的 BSP-A 水溶液 50 mL，并加入 5 g 预处理
BSP-A 质量浓度，g/L；V 为检测样品的体积，L；m 后的大孔树脂 AB-8，于 25 ℃下振荡 8 h，振荡后
为样品质量，g；r s 为回收率，%；w f 为脱蛋白后样 过滤取水相清液。将水相清液用蒸馏水在 25 ℃下透
品的 BSP-A 总糖质量分数，%；w a 为脱蛋白前样品 析 48 h 后在–40 ℃下冷冻干燥 48 h，再进行后续实验。
的 BSP-A 总糖质量分数，%。 1.2.4.4 三相分离法
1.2.3 BSP-A 蛋白质量分数的测定 取质量浓度为 10 g/L 的 BSP-A 水溶液 50 mL，
采用考马斯亮蓝法 [21] 测定样品中的蛋白质量分 向其加入 10 g (NH 4 ) 2 SO 4 ，搅拌至完全溶解后，再加
数，以牛血清白蛋白作为标准。得到标准曲线为：y= 入 75 mL 叔丁醇，在 25 ℃下搅拌 30 min，取出后
2
8.6228x+0.4023（R = 0.9984），x 为牛血清白蛋白质 离心取水相清液。将样品用蒸馏水在 25 ℃下透析
量浓度（g/L），y 为吸光度，线性范围 0~1 g/L。按 48 h 后在–40 ℃下冷冻干燥 48 h，再进行后续实验。
照式（3）和（4）分别计算 BSP-A 蛋白质量分数和 1.2.4.5 木瓜蛋白酶法
蛋白脱除率： 取质量浓度为 10 g/L 的 BSP-A 溶液 50 mL（以
V 0.01 mol/L，pH=6 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶
w / % 1 1 100 （3）
p m 1 液配制），向其加入含量（以 BSP-A 的质量为基准，
w w 下同）为 10 mg/g 的木瓜蛋白酶（>200 U/mg），在
r p /% pa pf 100 （4） 50 ℃酶解 2 h，并在中心温度 90 ℃下灭酶 5 min。
w pa 将样品用蒸馏水在 25 ℃下透析 48 h 后在–40 ℃下
式中：w p 为 BSP-A 蛋白质量分数，%；ρ 1 为用吸光
冷冻干燥 48 h，再进行后续实验。
度代入到牛血清白蛋白标准曲线后，计算得到的蛋
1.2.4.6 Sevage 法
白的质量浓度，g/L；V 1 为检测的样品体积，L；m 1
取质量浓度为 10 g/L 的 BSP-A 水溶液 50 mL，加
为样品质量，g；w pa 为脱蛋白前样品的 BSP-A 蛋白
入 12.5 mL Sevage 试剂〔V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=
质量分数，%；w pf 为脱蛋白后样品的 BSP-A 蛋白质
4∶1〕，在 25 ℃下搅拌 30 min，取出后离心取水相
量分数，%。
清液，此过程重复 5 次。将水相清液用蒸馏水在 25 ℃
1.2.4 BSP-A 脱蛋白的方法
下透析 48 h 后在–40 ℃下冷冻干燥 48 h，再进行后
配制质量浓度为 10 g/L 的 BSP-A 水溶液。分
续实验。
别用 TCA 法、TCA+正丁醇法、木瓜蛋白酶法、
1.2.5 BSP-A 结构分析
Sevage 法、三相分离法和大孔树脂 AB-8 吸附法脱
1.2.5.1 BSP-A 单糖含量测定
除 BSP-A 中的蛋白，以多糖回收率和蛋白脱除率来
将经过不同脱蛋白方法处理后的 BSP-A 样品
评价其纯化效果，并通过结构检测和抗氧化活性检 2 mg 与 4 mL 三氟乙酸水溶液（2 mol/L）在 110 ℃
测来评价其影响。
下水解 4 h，反应后添加 10 mL 甲醇，在 45 ℃下减
1.2.4.1 TCA 法 压除去三氟乙酸和甲醇。将残留物用超纯水溶解，
取质量浓度 10 g/L 的 BSP-A 水溶液 50 mL，按 过 0.22 μm 聚醚砜滤膜。采用离子色谱仪配以
体积比 1∶1 加入质量分数为 15 %的 TCA 水溶液， CarboPac PA1 分析柱（250 mm × 2 mm）和 CarboPac
搅拌 30 min，放入冰箱 4 ℃静置 12 h，取出后离心 PA1 保护柱（50 mm × 2 mm）连接进行测定。使用
取上清液。将上清液用蒸馏水在 25 ℃下透析（透 L-岩藻糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-
析膜截留相对分子质量 3500，下同）48 h 后在–40 ℃ 甘露糖、GalA 和 GlcA 标准品作为标准。
下冷冻干燥 48 h，再进行后续实验。 1.2.5.2 BSP-A 重均相对分子质量测定
1.2.4.2 TCA+正丁醇法 将经过不同脱蛋白方法处理后的 BSP-A 样品配
取质量浓度为 10 g/L 的 BSP-A 水溶液 50 mL， 制成质量分数为 0.5%的水溶液，过 0.22 μm 聚醚砜滤
按体积比 1∶1∶1 加入质量分数为 15%的 TCA 水溶 膜。用配备 TSK-G5000 PWXL（7.8 mm × 300 mm）
液和正丁醇，搅拌 30 min，放入冰箱 4 ℃静置 12 h， 和 TSK-GEL3500K PWXL（7.8 mm × 300 mm）串联
取出后离心取水相清液。将水相清液用蒸馏水在 分析柱的液相色谱仪测定相对分子质量及其分布。在
25 ℃下透析 48 h 后在–40 ℃下冷冻干燥 48 h，再进 柱温 35 ℃下，用 0.02 mol/L KH 2PO 4 水溶液作流动相，
行后续实验。 流速为 0.8 mL/min，进样量 10 μL。使用不同 M w
