Page 69 - 《精细化工》2023年第2期
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第 2 期                    陈浩莹，等:  碱提白芨粗多糖脱蛋白方法比较及抗氧化活性                                    ·291·


                 Key words:  Bletilla Striata; crude polysaccharide;  deproteinization methods; antioxidant activity;
                 modernization technology of traditional Chinese medicines


                 白芨（Bletilla striata）是一种具有重要研究意                噻唑啉-6-磺酸（ABTS）（生物级）、偶氮二异丁脒盐
            义的收敛止血中药，应用于治疗恶性溃疡、创伤性                             酸盐（AAPH）（生物级）、荧光素钠（AR）、水溶性
            出血、吐血、肺纤维化以及外伤性疾病，在中国已                             维生素 E（Trolox）、木瓜蛋白酶（生物级），大孔树
                           [1]
            有数千年的历史 。现代药理证实，白芨多糖（BSP）                          脂 AB-8，上海麦克林生化科技股份有限公司；L-岩藻
            是其主要成分，同时也是中国传统医药中的有效成                             糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、
              [2]
            分 。BSP 具有广泛的生物活性，如抗溃疡                  [3-4] 、止    D-半乳糖醛酸（GalA）和 D-葡萄糖醛酸（GlcA）标
              [5]
                                                   [9]
                                       [8]
                                [7]
                      [6]
            血 、抗炎 、抗氧化 、抗菌 、抗纤维化 和抗衰                           准品，美国 Sigma 公司；不同重均相对分子质量（M w）
            老 [10] 等。此外，白芨也是中医理论中许多皮肤护理                        的葡聚糖标准品，国家食品和药品控制研究所（北京）。
            经典配方的主要药物，并被广泛用于化妆品行业                      [11] 。      EYELA 旋转蒸发仪，东京理化公司；HR3050R
                 XU 等 [12]  研究还证实，BSP 对成纤维细胞不仅无                台式离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；
            毒性作用，还可以保护其免受 H 2O 2 引起的损伤。HU                      SZ-100Z 纳米颗粒分析仪，日本 HORIBA 公司；
            等 [13] 使用 BSP 制备了微针，并证实由质量浓度为                      Agilent 1260 型液相色谱仪，美国 Agilent 公司；ICS
            24 g/L  BSP 组成的微针可穿透皮肤，并将一种药物                      3000 型离子色谱仪，德国 Dionex 公司；Tensor 27
            模型-罗丹明 B（RhB）送入大鼠皮肤。水提醇沉法                          型傅里叶变换红外光谱仪，美国 Thermo Fisher
            是多糖提取的一种常用方法，利用多糖在水中的溶                             Scientific 公司；UV-2600 型紫外-可见分光光度计，
            解性和在乙醇中的不溶性，以达到对多糖的提取分                             日本 Shimadzu 公司；Synergy Neo2 型酶标仪，美国
            离。石猛等      [14] 研究表明，水提醇沉法可以去除水煎                   Biotek 公司。
            液中淀粉、树胶、果胶、黏液质、蛋白质、鞣质、                             1.2   实验方法
            色素、无机盐等水溶性杂质，在水溶液中醇的体积
                                                               1.2.1   白芨粗多糖的提取
            分数达到 75%时，可以除去蛋白质。但目前关于多                               提取前，干燥的白芨粉末（50 目，100 g）分别
            糖的研究     [15] ，植物多糖经初提时仍伴随着蛋白质的
                                                               用体积分数为 90%的乙醇水溶液 2 L 和体积分数为
            溶出，包括游离蛋白和多糖-蛋白质复合物，游离蛋
                                                               95%的石油醚水溶液 1 L 在室温 25  ℃下搅拌 2 h 以
            白的存在会影响后续多糖的纯化，不利于对其结构
                                                               清除杂质。抽滤后取滤渣，室温干燥后，得到预处
            和生物活性的研究。脱蛋白方法作为多糖纯化过程                             理粉末，置于密封袋中储存备用。碱提取 BSP 按照
            中的重要步骤，传统和近期研究的方法均见报道                      [16] ，
                                                               前期的研究进行       [19] 。具体过程如下：25 g 预处理粉
            如 Sevage 法、盐酸法、三氯乙酸法（TCA）、重复                       末，在 55  ℃下用 750 mL 0.01 mol/L NaOH 溶液提
            冻融法    [17] 、双醛纤维素法（DAC）        [18] 等。近期研究                                4
                                                               取 3 h，将上清液在 1.0×10  r/min 下离心 10 min，
            的 DAC 还没有进行量产，使用过程繁琐。在评价脱
                                                               用 0.5 mol/L 盐酸将上清液的 pH 调节到 7.0，提取
            蛋白方法优劣性时，除了多糖回收率和蛋白脱除率
                                                               过程重复两次。使用旋转蒸发仪将上清液浓缩至初
            作为重要指标，脱蛋白处理后的多糖结构和生物活
                                                               始体积的 1/3，向浓缩后的提取液中添加 4 倍提取液
            性也应成为方法评价的准则。
                                                               体积的无水乙醇，在 4  ℃下静置 24 h。过滤出白色
                 基于此，本研究拟采用前期研究探索的碱辅助
            方法  [19] 来提取 BSP，以多糖回收率和蛋白脱除率为                     絮状沉淀物，并用无水乙醇洗涤。溶解后，以蒸馏水
                                                               在 25  ℃下用截留相对分子质量 3500 的透析膜透析
            基本指标，辅以多糖初步结构表征和抗氧化活性，
                                                               48 h，浓缩后在–40  ℃下冷冻干燥 48 h，得到白芨
            比较不同的脱蛋白方法对 BSP 的影响和效果，进一
                                                               粗多糖（BSP-A）。
            步为 BSP 作为化妆品和医药制品原料在工业生产中
                                                               1.2.2  BSP-A 总糖质量分数的测定
            的开发提供理论依据。
                                                                   样品中 BSP-A 总糖质量分数按照苯酚硫酸法进
            1   实验部分                                           行测定   [20] ，以无水葡萄糖作为标准。得到标准曲线
                                                                                       2
                                                               为：y = 9.3466x + 0.0271（R  = 0.9974），x 为无水葡
            1.1   试剂与仪器                                        萄糖质量浓度（g/L），y 为吸光度，线性范围 0.01~
                 白芨块茎，广州大参林药店；无水葡萄糖、无                          0.10 g/L。BSP-A 总糖质量分数和回收率分别按
            水乙醇、三氯乙酸，AR，广州芊荟化玻仪器有限公                            式（1）和（2）计算：
            司；正丁醇（AR）、叔丁醇（AR）、考马斯亮蓝 G250、                                               V
                                                                               w  /%       100         （1）
            牛血清白蛋白（生物级）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并                                        s      m
   64   65   66   67   68   69   70   71   72   73   74