Page 71 - 《精细化工》2023年第2期

第 2 期 陈浩莹，等: 碱提白芨粗多糖脱蛋白方法比较及抗氧化活性 ·293·

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（ 1.305×10 、 3.680×10 、 6.465×10 、 1.335×10 、 来表示，使用 SPSS 24.0 统计软件进行分析。
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3.006×10 、6.700×10 ）的葡聚糖作为标准，以获得
M w 的校准曲线。 2 结果与讨论
1.2.5.3 FTIR 测试
2.1 碱辅助提取 BSP
称取 5 mg 经 过 不 同脱蛋 白方 法处理 后 的
经过预处理、稀碱液辅助提取、无水乙醇沉淀、
BSP-A 样品置于研钵中，与干燥的 KBr 粉末研磨和
透析以及冷冻干燥获得 BSP-A，其总糖质量分数为
压片。使用傅里叶变换红外光谱仪进行测试，波数 94.86%±0.56%，蛋白质量分数为 1.91%±0.24%。
–1
范围为 4000~500 cm 。
2.2 脱蛋白方法对 BSP-A 回收率的影响
1.2.5.4 Zeta 电位测试
不同的脱蛋白方法对 BSP-A 回收率的影响如图
配制质量浓度为 2 g/L 的 BSP-A 样品水溶液，
1 所示。由图 1 可知，Sevage 法、木瓜蛋白酶法和
使用纳米颗粒分析仪测定样品的 Zeta 电位。
三相分离法对 BSP-A 回收率达到 84%以上，反应相
1.3 体外抗氧化活性检测 对温和，没有引起 BSP-A 的损失。大孔树脂 AB-8
1.3.1 ABTS•抑制能力评价 是一种吸附型极性树脂，对溶液中的弱极性有机分
参照 CHEN 等 [19] 方法，测定 BSP-A 清除 ABTS•
子有较好的吸附性，而 BSP-A 水溶液本身带有一定
的能力。10 mL ABTS 水溶液（7 mmol/L）与 10 mL
的极性，所以部分 BSP-A 被大孔树脂 AB-8 吸附，
过硫酸钾水溶液（2.45 mmol/L）混合并在黑暗中放
损失较高。TCA 法和 TCA+正丁醇是利用酸性条件
置 16 h，用磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释 30~40 倍，
使蛋白变性，从而脱去蛋白，TCA 比盐酸温和，但
直到在 734 nm 处的吸光度为 0.70±0.02，得到 ABTS•
在本研究中，其对 BSP-A 的损失影响也较大。脱蛋
工作液。然后将 0.4 mL 不同质量浓度（0、0.5、1.0、
白处理是为了纯化多糖，而 BSP-A 的大量损失不符
2.0、3.0、4.0 和 5.0 g/L）的样品水溶液加入 3 mL
合研究预期，因此，认为 Sevage 法、木瓜蛋白酶法
ABTS•工作液。混匀反应试剂后，在 25 ℃下黑暗
和三相分离法更有利于 BSP-A 的保留。
培养 30 min，然后在 734 nm 处测定混合物的吸光

度。根据式（5）计算 ABTS•抑制率（%）：
 A  A 
ABTS抑制率 / %  1  i s   100 （5）
 A  A o 
c
式中：A c 为没有样品的混合物的吸光度；A i 为实验
组的吸光度；A s 为样品空白（蒸馏水代替 ABTS 水
溶液）的吸光度；A o 为没有样品的混合物和 ABTS
水溶液的吸光度。以 BSP-A 质量浓度为自变量，
ABTS•抑制率为因变量作图进行线性拟合，计算抑
制率为 50%时所需 BSP-A 的浓度（半抑制浓度）
（IC 50 ）。
1.3.2 氧自由基吸收能力（ORAC）评价
参照陈春 [22] 的方法，所有的试剂和样品溶液都是
用磷酸钾缓冲液（75 mmol/L，pH=7.4）配制的。在 图 1 不同脱蛋白方法对 BSP-A 回收率的影响
Fig. 1 Effect of different deproteinization methods on
96 孔板中加入 20 μL 样品溶液或 20 μL 不同浓度的
recovery rate of BSP-A
Trolox 标准液（TE）（3.125、6.25、12.5、25 μmol/L），
随后加入 200 μL 荧光素钠（0.0478 μmol/L）。设定酶 2.3 脱蛋白方法对蛋白质量分数的影响
标仪摇动混合物 10 s，并在 37 ℃下预孵化 10 min。 区别于其他多糖 [24-25] ，碱提 BSP 的蛋白质量分
在每个孔中加入 20 μL AAPH（119.4 mmol/L）后，使 数为 1.91%±0.24%，在未经过脱蛋白处理的前提下，
用酶标仪测量荧光强度，激发波长为 485 nm，发射 其在同类型物质中偏低。图 2 为不同脱蛋白方法对
波长为 538 nm，在 37 ℃下每 1.5 min 测定 1 次。根 BSP-A 蛋白质量分数和蛋白脱除率的影响。
据不同浓度的 Trolox 标准溶液中的荧光猝灭净面积 由图 2 可见，TCA+正丁醇法对 BSP-A 的脱蛋白
（NET AUC）得到标准曲线。样品的 NET AUC 代 效果最佳，蛋白脱除率达到了 90.31%，这可能是由
入标准曲线计算 ORAC 值（μmol TE/g） [23] 。 于除了游离蛋白，TCA 和正丁醇的加入还促进了多
1.4 数据统计分析 糖-蛋白复合物的降解 [26] 。除此之外，TCA 法和大
所有实验重复 3 次，结果以“平均值±标准差” 孔树脂 AB-8 吸附法也达到了一定的脱蛋白效