Page 130 - 《精细化工》2023年第5期

·1050· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

因，然后按图 2 所示的流程分别获得 E. coli BL21 转接至 100 mL LB 液体培养基中，37 ℃、200 r/min
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 振荡培养至 OD 600 =0.6 左右（其中，OD 600 是指在波
和 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: 长 600 nm 处的吸光度），加入终浓度为 0.1 mmol/L
M
pET28a-CbFDH 重组菌。将上述重组菌在无抗 LB 的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）后进行 16 ℃低温
培养基上连续培养 10 次，然后接种至同时含卡拉霉 诱导。收集诱导后的菌体，一部分用 10 mL 100
素和氯霉素的 LB 培养基上培养，观察生长情况， mmol/L 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）重
以双重抗性筛选方法来考察重组菌携带质粒的遗传 悬后进行超声破碎，然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙
稳定性 [14] 。 烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析 [15] 。另一部分
1.2.2 重组大肠杆菌诱导方法 采用冻干机在–40 ℃下进行重组大肠杆菌的菌体冻
为了降低包涵体的产生，提高可溶性表达效率， 干，将获得的冻干的重组大肠杆菌用于全细胞催化
本研究采取低温诱导的策略对上述重组大肠杆菌进 L-苏氨酸合成 L-2-氨基丁酸。
行诱导表达 。分别将 E. c o l i BL21 (DE 3 )/ 1.2.3 酶活测定方法
pACYCDuet-1、E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1- 取上清液参照文献[16-17]测定各重组酶的酶
EcTD、E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD- 活。以 L-苏氨酸为底物构建体系测定 EcTD 的酶活，
EsLeuDH、E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD- 酶活定义为 1 min 内生成 1 μmol 2-酮丁酸所需的酶
EsLeuDH: pET28a-CbFDH、E. coli BL21 (DE3)/ 量为 1 IU。以 2-酮丁酸为底物测定 EsLeuDH 的酶活，
M
pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 、 酶活定义为在 1 min 内消耗 1 μmol 辅酶 NADH 所需
E. coli BL21 (DE3)/pET28a-CbFDH、E. coli BL21 的酶量为 1 IU。以甲酸钠为底物测定 CbFDH 的酶
(DE3)/pET28a-EsLeuDH 单菌落接种到试管 LB 液体 活，酶活定义为 1 min 内生成 1 μmol NADH 所需的
培养基中，培养 12~14 h 后，按体积分数 2%接种量 酶量为 1 IU。

注：MCS1 和 MCS2 分别为表达质粒 pACYCDuet-1 的克隆位点 1 和克隆位点 2；EcTD 为 L-苏氨酸脱氨酶；BamHⅠ、Hind Ⅲ、
Xho Ⅰ和 Nde Ⅰ为 4 种不同的限制性内切酶

图 2 构建重组质粒及重组大肠杆菌的示意图
Fig. 2 Schematic diagram of constructing recombinant plasmids and recombinant E. coli strains

1.2.4 重组大肠杆菌全细胞转化 L-苏氨酸合成 L-ABA 离心，将上清液稀释适当倍数后用 0.22 μm 有机系滤
在 250 mL 三角瓶中构建 50 mL 反应体系，体 膜进行过滤，用 HPLC 检测转化液中 L-ABA 的含量，
系包括：200 mmol/L L-苏氨酸、200 mmol/L 甲酸铵、 并绘制 L-ABA 得率与时间的关系曲线。
+
0.75 mmol/L 辅酶 NAD 、50 mg 冻干的重组大肠杆 1.2.5 不同温度对合成 L-ABA 的影响
菌和适量的玻璃珠，并于 30 ℃、220 r/min 条件下 为了考察不同温度下全细胞催化 L-苏氨酸合成
振荡反应 12 h，期间间隔 2 h 取 1 mL 转化液并高速 L-ABA 的合成效率，结合实际生产中较易达到的温