Page 132 - 《精细化工》2023年第5期

·1052· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

生物工程（上海）股份有限公司进行测序，结果表 coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD、E. coli BL21
明，EsLeuDH 的序列及其在载体上的插入位置与预 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH、E. coli BL21
期 一 致 ，表明 已成 功构建 E. coli BL21 (DE3)/ (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH、
pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH 重组菌。 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH:
M
pET28a-CbFDH 、 E. coli BL21 (DE3)/pET28a-
CbFDH、E. coli BL21 (DE3)/pET28a-EsLeuDH 重组
菌按照 1.2.2 节方法进行诱导表达，将诱导离心后的
菌液经重悬破碎后进行 SDS-PAGE 及酶活分析。
SDS-PAGE 的结果如图 5 所示。由图 5 可见，E. coli
BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-
CbFDH 的裂解上清液在 56 和 38~43 kDa 处有明显
的特异性条带，理论上分别与 EcTD、EsLeuDH 和
CbFDH 的相对分子质量一致，表明 3 个目标酶均已

成功实现表达。
注：M 为 DNA 标记；图 4a 中 1 为重组菌 E. coli BL21
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH 的菌液 PCR 检测泳道；图
4b 图中 1、2 分别为重组质粒 pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH 的
双酶切验证泳道
图 4 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH
重组菌的菌液 PCR 检测（a）及双酶切验证（b）
Fig. 4 PCR detection (a) and double enzyme digestion
verification (b) of E. coli BL21 (DE3)/
pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH

最后，分别将 pET28a-CbFDH 质粒和 pET28a-
M
CbFDH 质粒与 pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH 质粒

同时转化至 E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，经卡拉 注：M 为蛋白标记；1 为 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1；2
霉素和氯霉素双抗性筛选，获得 E. coli BL21 为 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD；3 为 E. coli BL21
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH ； 4 为 E. coli BL21
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH；5 为 E.
M
和 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH
M
pET28a-CbFDH 重组菌。重组菌生长状况良好，表 图 5 重组大肠菌表达产物的 SDS-PAGE 分析
Fig. 5 SDS-PAGE analysis for the expression products of
明该重组菌能够用于后续的全细胞催化研究。 recombinant E. coli strains
2.2 重组大肠杆菌的诱导表达及鉴定
分别将 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1、E. 各重组菌的酶活测定结果如表 2 所示。

表 2 各重组菌的酶活分析
Table 2 Enzyme activity analysis of each recombinant
重组菌 L-TD/(IU/mL) L-LDH/(IU/mL) FDH/(IU/mL)
E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1 246.00 ± 7.40 — —
E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD 5046.00 ± 16.20 — —
E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH 4985.00 ± 12.50 182.00 ± 5.30 —
E. coli BL21 (DE3)/pET28a-CbFDH 265.00 ± 7.80 — 212.00 ± 6.70
E. coli BL21 (DE3)/pET28a-EsLeuDH 258.00 ± 6.98 226.00 ± 6.50 —
E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 4680.00 ± 10.60 174.00 ± 4.60 196.00 ± 6.20
M
E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 4635.40 ± 9.70 182.00 ± 5.50 342.00 ± 9.40
注：“—”表示没有显示出该酶的酶活。

由表 2 可知 ，在 E. coli BL21 (DE3)/ CbFDH 的活 性，其分 别为 (4680.00±10.60) 、
pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 的 (174.00±4.60)和(196.00±6.20) IU/mL，3 种酶共表达时
细胞裂解液中同时检测到了 EcTD、EsLeuDH 和 的酶活略低于它们单独表达时的酶活。同时也发现，