Page 133 - 《精细化工》2023年第5期

第 5 期 李 莹，等: 过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成 L-2-氨基丁酸的效率 ·1053·

L-苏氨酸脱氨酶在大肠杆菌中存在一定量的本底表
达，但其表达水平远远低于重组质粒的诱导表达水
平。另外，E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-
M
EsLeuDH: pET28a-CbFDH 中的甲酸脱氢酶酶活达
到了(342.00±9.40) IU/mL，显著高于 E. coli BL21
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH
的表达水平〔(196.00±6.20) IU/mL〕。结合前期报
道的结果，E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-
M
EsLeuDH: pET28a-CbFDH 中甲酸脱氢酶酶活水平的

M
显著提高主要归因于 CbFDH 比酶活的提高 [10] 。酶 图 6 反应产物的 HPLC 谱图
活测定结果更进一步表明，构建双质粒共表达系统 Fig. 6 HPLC spectrum of reaction product
成功构建了能实现 EcTD、EsLeuDH 和 CbFDH 3 个
在 16.3725 和 12.4925 min 处明显有特征峰存
目标酶同时表达的微生物细胞工厂，且具有催化 L-
在，这与相同 HPLC 分析条件下 L-ABA 和 L-苏氨
苏氨酸合成 L-ABA 的潜力。
酸的保留时间一致，且前者的峰面积明显大于后者，
此外，为了进一步比较这些重组酶的酶学特性，
表明在该催化条件下，实现了对 L-苏氨酸的大部分
进而初步探索各重组大肠杆菌合成 L-ABA 效率差
转化。而 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1 的催化
异的机制，本文基于课题组前期的研究及已报道的
产物仅在 12.4925 min 处有明显的特征峰，表明该重
文献进行了总结对比，结果如表 3 所示。 组菌没有将 L-苏氨酸转化成 L-ABA 的能力。
按 1.2.4 节实验方法，在不同时间取样分析、计
表 3 各重组酶的代表性酶学特性
Table 3 Representative enzymatic characteristics of each 算各时间节点产物的得率，结果如图 7 所示。
recombinant enzyme
K cat/K m/
酶 K m/(mmol/L) K cat/s –1 参考文献
〔(L/(s·mmol)〕
EcTD 3.54 2.49 0.70 [16]
EsLeuDH 0.91 0.30 0.32 [18]
CbFDH 52.40 3.20 0.06 [10,12]
M
CbFDH 40.10 9.60 0.24 [10,12]
注：K m 为酶促反应速度达到最大反应速度一半时所对应的
–1
底物浓度，是酶的特征常数之一，mmol/L；K cat 为催化常数（s ），
又叫做转换数（TN 值，mmol/L），K cat 越大，表示酶的催化效率

越高；K cat/K m 为酶专一性常数或对不同底物的优先权的一种衡
量〔(L/(s·mmol)〕，当两种底物以相同浓度竞争同一种酶的活性 图 7 不同甲酸脱氢酶对 L-ABA 得率的影响
部位时，其转变成产物的速率比是与它们的 K cat/K m 相等。 Fig. 7 Effect of different formate dehydrogenases on
L-ABA yield
M
由表 3 可知，CbFDH 的催化常数显著高于
由图 7 可知，当时间为 6 h 时，反应基本达到
CbFDH 的催化常数，因此，在相同蛋白表达水平的 平衡状态，L-ABA 得率基本不再随时间的变化而变
M
情况下，CbFDH 也能表现出更高的催化活性，体
化。此外，携带更高活性甲酸脱氢酶的重组菌 E. coli
现出更强的辅酶再生能力，在合成 L-ABA 的过程中 BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-
M
也会更具潜力。 CbFDH 的催化活性明显高于 E. coli BL21 (DE3)/
2.3 重组 大肠杆菌全细胞催化 L- 苏氨酸合 成 pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH。反应
L-ABA 6 h 时，前者的得率为 85%，而后者的得率仅为 71%，
2.3.1 不同甲酸脱氢酶对 L-ABA 合成的影响 强化后的重组大肠杆菌较未强化的得率提高 14%，表
按照全细胞催化法进行 L-苏氨酸的生物转化。 明通过增强甲酸脱氢酶的表达水平，可显著提高 NADH
对 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: 的再生能力，进而能显著提高 L-ABA 的合成效率。
pET28a-CbFDH 和 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet- 2.3.2 不同温度对 L-ABA 合成的影响
1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH M 的催化产物取 为了进一步提高 L-ABA 的合成效率，按 1.2.5
样，经离心后进行 HPLC 分析，结果见图 6。 节实验方法考察了反应温度对 L-ABA 得率的影响，