Page 131 - 《精细化工》2023年第5期

第 5 期 李 莹，等: 过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成 L-2-氨基丁酸的效率 ·1051·

度范围，参照 1.2.4 节反应体系，测定了 E. coli BL21 1.2.7 数据统计及图表绘制方法
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH M 本文中的图片均用 Adobe Photoshop CS 8.0 软
细胞在 25、30 和 35 ℃下合成 L-ABA 的情况，并 件进行处理，借助 Origin 9 完成数据分析及处理。
绘制不同温度下 L-ABA 得率与时间的关系曲线。
1.2.6 底物和产物的检测 2 结果与讨论

对底物 L-苏氨酸、产物 L-ABA 进行普通 C 18
柱的 HPLC 分析，通过柱前衍生测定 [4,17] ，HPLC 色 2.1 重组大肠杆菌的构建
按照重组菌的构建方法将质粒 pACYCDuet-1 与
谱柱为 Thermo Hypersil C18 柱， 检测波长为
EcTD 编码基因的 PCR 扩增产物同时进行双酶切，
360 nm，室温，流动相 A〔V(去离子水)∶V(乙
将酶切后的 EcTD 和 pACYCDuet-1 连接并热激转化
腈)=1∶1〕与流动相 B（pH=6.4 的 0.05 mol/L 乙酸
至 E. coli BL21 感受态细胞，在含氯霉素的 LB 平板
钠水溶液），按照表 1 的洗脱梯度进行梯度洗脱，设
上筛选获得重组菌。挑取重组菌用通用引物进行
定流速为 1 mL/min。用超纯水将 L-ABA 标准品配
PCR 检测，结果如图 3a 所示，检测片段大小约 2000
成 1、3、5、7、9 mmol/L 溶液，进行柱前衍生化反
bp，与预期相符。进一步提取质粒进行双酶切验证，
应，经 0.22 μm 有机系滤膜过滤后，取 10 μL 进行
结果如图 3b 所示，表明双酶切后能够释放出与目的
HPLC 分析，将各个浓度 L-ABA 的峰面积与各个浓
片段长度一致的片段，约为 1800 bp。将经 PCR 检
度进行线性拟合获得回归方程及相关系数。待检样
测和双酶切验证的重组菌送至生工生物工程（上海）
品产物按照同样的色谱条件进行柱前衍生 HPLC 分
股份有限公司进行测序。结果表明，编码 EcTD 的
析，可以由回归方程结合所测峰面积计算出相应的
序列及该序列在表达载体上的插入位置与预期的结
样品浓度。
果 相 符 ，表明 已成 功构建 E. coli BL21 (DE3)/
表 1 HPLC 洗脱梯度 pACYCDuet-1-EcTD 重组菌。
Table 1 HPLC elution gradients
流动相 A 流动相 B
序号 时间/min
体积分数/% 体积分数/%
1 0 16 84
2 0 16 84
3 2.4 30 70
4 4.2 34 66
5 7.2 43 57
6 13.3 55 45
7 15.0 55 45
8 20.4 98 2
注：M 为 DNA 标记；图 3a 中 1 为重组菌 E. coli BL21
9 21.3 16 84
(DE3)/pACYCDuet-1-EcTD 的菌液 PCR 检测泳道；图 3b 图中 1、
10 30.0 16 84 2 分别为重组质粒 pACYCDuet-1-EcTD 的双酶切验证泳道
图 3 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-EcTD 重组菌的
在上述分析条件下，L-ABA 标准品的保留时间
菌液 PCR 检测（a）及双酶切验证（b）
约为 16.37 min，将与不同浓度（x，mmol/L）的 L-ABA Fig. 3 PCR detection (a) and double enzyme digestion
标准品相对应的峰面积（y）进行线性拟合，获得标 verification (b) of E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-
1-EcTD recombinant strain
准曲线，得 出 L-ABA 浓度相应的 回归方程为
2
y=760.05x–743.22，相关系数（R ）为 0.9907，该结 同样，将重组质粒 pACYCDuet-1-EcTD 和
果表明，在上述 HPLC 分析条件及 L-ABA 浓度范围 EsLeuDH 基因的 PCR 扩增产物同时进行双酶切，将
下，L-ABA 浓度与其相应的峰面积呈现出良好的线 酶切后的 EsLeuDH 和 pACYCDuet-1-EcTD 连接并
性关系，因此，利用此法可以得到 L-ABA 得率。同 热激转化至 E. coli BL21 感受态细胞，同样在含氯
样条件下对底物 L-苏氨酸进行 HPLC 分析，得到 L- 霉素的 LB 平板上筛选获得重组菌。挑取阳性重组
苏氨酸的保留时间约为 12.49 min。由此可见，L-苏 菌用通用引物进行 PCR 检测，结果如图 4a 所示，
氨酸的保留时间比 L-ABA 的保留时间约短 4 min， 片段大小约 1400 bp，与预期相符。进一步提取质粒
结果表明，在该色谱条件下能够实现 L-苏氨酸与 进行双酶切验证，结果如图 4b 所示，双酶切后能够
L-ABA 的良好分离，该色谱方法能够用于催化产物 释放出与 EsLeuDH 长度一致的目的片段，大小约为
的分析鉴定。 1100 bp。将经 PCR 检测和酶切验证的重组菌送生工