Page 134 - 《精细化工》2023年第5期
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·1054·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

            结果如图 8 所示。                                         白,以提高底物的跨膜效率,进而进一步提高 L-ABA
                                                               的合成效率,降低其合成成本,以实现其工业化生产。

                                                               3   结论

                                                                  (1)成功构建了 2 个能够同时表达 L-苏氨酸脱
                                                               氨酶、L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶 3 种酶的重组
                                                               大肠杆菌 E. coli BL21 (DE3)/pACYCDuet-1-
                                                               EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 和 E. coli BL21 (DE3)/
                                                                                                         M
                                                               pACYCDuet-1-EcTD-EsLeuDH: pET28a-CbFDH 。
                                                               两种重组菌均能成功同时表达 L-苏氨酸脱氨酶、L-

                                                               亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶,且后者的甲酸脱氢酶
                  图 8   不同反应温度对 L-ABA 得率的影响
            Fig. 8    Effect of different reaction temperatures on L-ABA   酶活表达水平显著高于前者。
                   yield                                          ( 2 ) 两种重 组菌 在 50 mL 反应体 系中 ,
                                                               200 mmol/L L-苏氨酸经 220 r/min、30  ℃下反应 6 h
                 由于在实际生产中,25~35  ℃的温度范围相对
                                                               时,L-ABA 的得率为分别为 71%和 85%,表明通过
            较为温和,较易达到,因此,本研究所考察的温度
                                                               强化甲酸脱氢酶的表达水平能够显著提高 L-ABA
            为 25、30 和 35  ℃。由图 8 可见,在这 3 个温度下,
                                                               的合成效率。
            温度越高,L-ABA 得率也越高,这也符合一般酶促                             (3)对反应温度进行优化后,L-ABA 的得率可
            反应的规律。在 35  ℃下反应 6 h 时,L-ABA 的得                    以达到 90%,时空产率可以达到 3.09 g/(Lh)。
            率达到 90%,时空产率可以达到 3.09 g/(Lh)。                        (4)尽管本研究实现了 L-ABA 的生物合成,
                 上述这些结果充分验证了前期提出的强化甲酸                          但与前人报道的 L-ABA 的时空产率〔5.02 g/(Lh)〕、
            脱氢酶的表达水平能显著提高 L-ABA 合成效率的                          得率(95%)相比,仍然偏低。本研究也发现,该
            假设。值得思考的是,与前人报道的 L-ABA 的时空                         反应的限速酶应该是 L-亮氨酸脱氢酶,下一步的研
            产率〔5.02 g/(Lh)〕、得率(95%)相比            [18] ,本研     究中应继续强化 L-亮氨酸脱氢酶的表达,同时对 L-
            究中甲酸脱氢酶的表达水平虽已显著提高,但                               苏氨酸脱氨酶的表达可以适当减弱。
            L-ABA 的得率和时空产率仍然偏低。经分析比较,
            这可能归因于本研究所构建的重组菌所产 L-亮氨酸                           参考文献:
            脱氢酶的活性仍然不够,在本研究中 L-亮氨酸脱氢                           [1]   RAONI S  B G,  EMERSON  T D S,  VINICIUS N D  S M. An
                                                                   environmentally friendly, scalable and highly efficient synthesis of
            酶的表达水平还不及甲酸脱氢酶的水平,因此,在                                 (S,S)-ethambutol, a first line drug against tuberculosis[J]. Letters in
            下一步研究中仍需对 L-亮氨酸脱氢酶的表达水平进                               Organic Chemistry, 2015, 12(7): 478-481.
                                                               [2]   BAI G  Y (白国义),  CHEN L G  (陈立功), XING P (邢鹏),  et al.
            行深度强化。此外,通过反应进程曲线可以明显看                                 Synthesis of ethambutol[J]. Fine Chemicals (精细化工), 2004,
            出,催化反应在前 2 h 比较迅速,后期产物增长比                              21(12): 943-945.
            较缓慢,且难以达到前人报道的 99%的转化率                    [6,19] 。  [3]   SHIN J S, KIM B G.  Transaminase-catalyzed asymmol/letric
                                                                   synthesis of L-2-aminobutyric acid from  achiral reactants[J].
            经过比对分析,本研究反应所用的转速明显低于前                                 Biotechlogy Letters, 2009, 31(10): 1595-1599.
            人设定的 600 r/min   [19] ,尽管已经添加了一定量的玻                [4]   LI J Q (李建强).  Study on L-2-aminobutyric acid production by
                                                                   recombinant Escherichia coli[D]. Hangzhou: Zhejiang University of
            璃珠,一定程度上可以提高传质效果,但随着反应                                 Technology (浙江工业大学), 2019.
                                                               [5]   KE C R, YANG X W, RAO H X,  et al. Whole-cell conversion of
            的进行,胞外 L-苏氨酸的浓度逐渐降低,底物可能                               L-glutamic  acid  into  gammol/L-2-aminobutyric  acid  by
            会难以进入胞内,而胞外 L-ABA 又不断积累,产物                             metabolically engineered Escherichia coli[J]. SpringerPlus, 2016, 5:
                                                                   591.
            会更难从胞内释放出来,这可能会大大限制后续反
                                                               [6]   FU Y (付妍), ZHANG J  X (张君轩), FU X  R (付雪蓉),  et al.
            应的催化效率。                                                Production of L-2-aminobutyric acid from L-threonine catalyzed by
                                                                   three enzyme cascade[J]. Journal of Biological Engineering (生物工
                 另外,本研究还发现,大肠杆菌中 L-苏氨酸脱
                                                                   程学报), 2020, 36(4): 782-791.
            氨酶的本底水平较高,为(246.00±7.40) IU/mL,在                   [7]   GALKIN A,  KULAKOVA L, YOSHIMURA T,  et al. Synthesis of
                                                                   optically active aminoacids from alpha-keto acids with Escherichia
            本研究的反应路线中,L-苏氨酸脱氨酶不是限速酶。
                                                                   coli cells expressing heterologous genes[J]. Appl Environ Microbiol,
            相反,L-苏氨酸脱氨酶的过量表达可能还会降低其                                1997, 63(12): 4651-4656.
                                                               [8]   TAO R S, JIANG Y, ZHU F Y, et al. A one-pot system for production
            他两个关键酶的表达,进而影响 L-ABA 总体合成效
                                                                   of L-2-aminobutyric acid from  L-threonine by L-threonine
            率。因此,在下一步的研究中,可以考虑将克隆 L-                               deaminase and a  NADH-regeneration system based on L-leucine
                                                                   dehydrogenase and formate dehydrogenase[J]. Biotechlogy Letters,
            苏氨酸脱氨酶的多克隆位点换成 L-亮氨酸脱氢酶,提
                                                                   2014, 36(4): 835-841.
            高关键酶的表达效率,或者过表达 L-苏氨酸转运蛋                                                         (下转第 1072 页)
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