Page 129 - 《精细化工》2023年第5期

第 5 期 李 莹，等: 过量表达甲酸脱氢酶提高大肠杆菌合成 L-2-氨基丁酸的效率 ·1049·

L-2-氨基丁酸（L-ABA）是一种重要的非天然 L-ABA 生物合成效率的影响。本研究有望实现
氨基酸，作为重要的药物中间体可用于左乙拉西坦 L-ABA 低成本、高效率的生物合成，为 L-苏氨酸的
等抗癫痫药物的合成 [1-3] 。目前，常用的 L-ABA 合 转产增值奠定坚实的理论基础。
成工艺有化学合成和生物合成两类。
传统化学合成易形成外消旋体，不利于产物纯 1 实验部分
化，环境污染严重，因而不宜进行工业化生产。生
1.1 试剂与仪器
物合成法主要有生物发酵法、转氨酶法和氨基酸脱 L-苏氨酸（HPLC 纯度≥99%），北京索莱宝科
氢酶法 [4-5] 。生物发酵法主要是对产 L-苏氨酸的大肠
技有限公司；L-ABA（HPLC 纯度 99%）、2,4-二硝
杆菌进行改造，改造后的菌株能在含质量浓度为
基氟苯（HPLC 纯度 98%），上海麦克林生化科技股
30 g/L 的葡萄糖培养基中合成质量浓度 5.4 g/L 的 份有限公司；乙腈、甲醇，色谱纯，天津市科密欧
[6]
L-ABA，糖酸转化率有待进一步提高 。转氨酶法 +
化学试剂有限公司；辅酶 NAD （烟酰胺腺嘌呤二
是以 2-酮丁酸为底物，L-天冬氨酸为氨基供体进行
核苷酸），分析纯，深圳邦泰生物工程有限公司，其
合成，会产生大量的 L-丙氨酸副产物，不利于后续
他试剂均为国产分析纯。
的分离。传统氨基酸脱氢酶法受限于氨基酸脱氢酶
FreeZone®冷冻干燥机，美国 Labconco 公司；
活性较低，对底物转化率不高，且底物 2-酮丁酸本
DYY-6C 型核酸电泳仪，北京市六一仪器厂；Power
身也不稳定，这会增加底物和酶的消耗，进而增加 Pac HC 型蛋白电泳仪，美国 Bio-Rad 公司；EC 2006
L-ABA 的生产成本 [7-8] 。后来，通过逐步引入 L-苏
型高效液相色谱（HPLC）系统，大连依利特分析仪器
氨酸脱氨酶（L-TD）能将廉价的 L-苏氨酸转化成
有限公司；Hypersil C 18 柱，美国 Thermo Scientific 公司。
2-酮丁酸，然后通过 L-亮氨酸脱氢酶（L-L-DH）和
1.1.1 菌株和质粒
甲酸脱氢酶（FDH）进行 L-ABA 的生物合成，大大 Escherichia coli BL21 (DE3)、携带高活性甲酸
[6]
提高了合成效率，L-ABA 的产率达到了 97.3% 。 M
脱氢酶 CbFDH 和 CbFDH 基因的重组大肠杆菌 E.
本课题组在前期研究工作中，获得了一系列高活性 coli BL21 (DE3)/pET28a-CbFDH 和 E. coli BL21
[9]
的 L-亮氨酸脱氢酶 和甲酸脱氢酶 [10] ，前期研究为 (DE3)/pET28a-CbFDH M 菌株由本课题组构建和保
L-ABA 的生物合成及实现 L-苏氨酸的转产增值奠 藏 [10,12] 。其中，与 CbFDH 相比，CbFDH M 含有
定了坚实的基础。本研究拟采用图 1 所示的合成路 S23C/E53V/E202D/E325Q/L184V/K328V 共 6 个位
线，通过构建含双质粒的重组菌，实现 L-苏氨酸脱 点 的 突 变。重 组大 肠杆菌 E. coli BL21 (DE3)/
氨酶、L-亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶 3 种酶共表达， pET28a-EsLeuDH [13] 由许建和教授馈赠，表达质粒
以实现 3 酶级联协同催化 L-苏氨酸合成 L-ABA，进 pACYCDuet-1 由本课题组保藏。
而采用全细胞催化的方法高效合成 L-ABA。由于在 1.1.2 培养基
羰基不对称胺化还原过程中需要消耗还原型烟酰胺 LB 培养基：液体培养基添加（均为质量浓度）
腺嘌呤二核苷酸（NADH），因此，该反应偶联了甲 10 g/L 蛋白胨、10 g/L 氯化钠和 5 g/L 酵母提取物，
酸脱氢酶介导的辅酶再生系统 [11] 。此外，已有研究 固体培养基则需额外添加 20 g/L 琼脂粉，自然 pH，
报道强化 NADH 的再生能力能够显著提高 L-苯甘 121 ℃灭菌 20 min，用于大肠杆菌的培养。
氨酸合成的效率 [10] 。 1.2 方法

1.2.1 重组菌的构建
从 National Center for Biotechnology Information
(https://ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索到一个大肠杆菌来
源的 L- 苏氨 酸脱 氨酶 EcTD （ GenBank:
NP_418220.1 ），其对 应基因的 序列号为 ：
NC_000913.3:3955331-3956875。根据此序列设计扩
增 EcTD 的特异性引物 EcTD-F: CGGGATCCGA-
TGGCTGACTCGCAACCC（含 BamH Ⅰ酶切位点）和

图 1 以 L-苏氨酸为底物合成 L-ABA 的路线示意图 EcTD-R: CCCAAGCTTCTAACCCGCCAAAAAGAAC
Fig. 1 Schematic diagram of synthesis route of L-ABA （含 Hind Ⅲ酶切位点），并委托苏州弘讯生物技术
from L-threonine as substrate
有限公司进行合成。以 E. coli BL21 (DE3)的基因组
因此，本研究试图借助强化甲酸脱氢酶的表达 DNA 为模板，利用特异性引物 EcTD-F 和 EcTD-R
来调节辅酶再生能力，并考察不同甲酸脱氢酶对 进行聚合酶链式反应（PCR）扩增 EcTD 的编码基