Page 123 - 《精细化工》2023年第9期
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第 9 期               褚帅北，等: ARTP-DES 复合诱变结合前体耐受性选育达托霉素高产菌株                               ·1971·


            pH 7.0。所用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）液体培养基                        1.2.5  ARTP-DES 复合诱变选育高产菌株
            （均为质量浓度）：TSB 30.0 g/L，pH 自然。所用种                        选取 ARTP 诱变致死率在 70%~80%的照射时间
            子培养基（均为质量浓度）：葡萄糖 5.0 g/L、麦芽                        为 ARTP 诱变条件，以 1.2.3 节方法对出发菌株的单
            糊精 15.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、酵母粉 10.0 g/L，             孢子悬液进行 ARTP 诱变处理，得到经 ARTP 诱变
            pH 7.0。所用发酵培养基（均为质量浓度）：葡萄糖                         后的孢子悬液。用 pH 为 7 的磷酸缓冲液将 ARTP
            10.0 g/L、麦芽糊精 80.0 g/L、糖蜜 5.0 g/L、黄豆饼              诱变后的孢子悬液稀释至 20 mL，再加入合适浓度
            粉 30.0 g/L、麸质粉 5.0 g/L、碳酸钙 2.0 g/L、六水合             的 DES，30  ℃反应 20 min，反应结束后加入质量
            氯化镍 0.2 g/L、二水合钼酸钠 0.1 g/L、六水合硫酸亚                  分数为 25%的硫代硫酸钠水溶液 1 mL 终止反应，
            铁铵 0.66 g/L、草酸 4.0 g/L、硫辛酸 0.005 g/L、维生            得到 ARTP-DES 诱变孢子悬液。将 ARTP-DES 诱变
            素 B 12 0.002 g/L，pH 7.5。                           孢子悬液用无菌水稀释 100 倍后涂布于 DT 平板中，
            1.2.1   单孢子悬液的制备                                   长出的单菌落扩大培养后进行摇瓶培养发酵，采用
                 将甘油管保藏的原始菌株 AN-126 的单孢子悬                      高效液相色谱法测定达托霉素产量。
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            液（1×10 ~1×10  CFU/mL）从–80  ℃超低温保存箱                 1.2.6  ARTP-DES 结合癸酸钠耐受性选育高产菌株
            中取出，解冻后用无菌水稀释 100 倍后取 200 µL 涂                         将 1.2.5 节中得到的 ARTP-DES 诱变菌悬液稀
            布于 DT 平板中，30  ℃培养 8~10 d。挑取单菌落划                    释后涂布于 1 MIC 癸酸钠的 DT 平板上，将长出的
            线扩大培养 8~10 d，待孢子成熟后，用无菌水将孢                         单菌落扩大培养后进行摇瓶培养发酵，采用高效液
            子冲洗至 10 mL 离心管中，涡旋振荡 10 min 后用 4                   相色谱法测定达托霉素产量。
            层滤纸过滤，最终制成的单孢子悬液浓度约为 1×                            1.2.7   摇瓶培养发酵
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            10 ~1×10  CFU/mL。                                      用一次性接种环将在 24 孔板中生长待测的菌株
            1.2.2   癸酸钠最小抑制浓度（MIC）的测定                          刮取一满环，接入装有 20 mL 种子培养基的 100 mL
                 配制含有不同癸酸钠质量浓度梯度（0、2、4、                        锥形瓶中，30  ℃、250 r/min 培养 2 d，然后按照 10%
            6、8、10 g/L）的 DT 固体培养基。取 200 µL 单孢                  的接种量用移液器吸取 2 mL 种子液移至装有 18 mL
            子悬液涂布于含有不同癸酸钠质量浓度的 DT 平板                           发酵培养基的 100 mL 锥形瓶中 30  ℃、250 r/min 培
            中，30  ℃培养 8~10 d，确定癸酸钠的 MIC。                       养 6 d。
            1.2.3  ARTP 诱变致死率曲线的测定                             1.2.8   发酵液中产物的分析
                 取 10 µL 单孢子悬液于直径 1 cm 的圆形铁片                       发酵液处理办法：取发酵液 10 mL 于 15 mL 离
            上，以氦气为工作气体，功率设定 110 W，工作气                          心管中，12000 r/min 下离心 10 min；取 1 mL 上清
            流 10 L/min，照射距离 2 mm，设置照射时间 15、                    液至新的 15 mL 离心管中，加入 4 mL 无水乙醇，
            30、45、60、75、90、105、120 s，以时间为诱变                    超声波清洗器混匀振荡 10 min，再在 12000 r/min 下
            梯度进行诱变，诱变后涂布平板。培养皿 30  ℃倒                          离心 10 min；用一次性无菌注射器（1 mL）吸取 1 mL
            置培养 6~8 d，以未经 ARTP 处理的单孢子悬液涂布                      上清液，经 0.22 µm 有机系滤膜过滤至 HPLC 取样
            的平板作为对照，制作致死率曲线。致死率按式（1）                           瓶中待测。
            计算：                                                    HPLC 操作条件：分析柱为 InertSustain C18
                                    
                                   AD                          （4.6 mm×250 mm×5.0 µm）；流速 1.0 mL/min；采
                            R /%        100         （1）
                                    A                          用 220 nm 可见光紫外检测器；柱温 40  ℃；进样量
            式中：R 为致死率，%；A 为未经诱变的平板中长                           10 µL；将 450 mL 乙腈和 550 mL 体积分数为 0.1%
            出的菌落数，个；D 为诱变后的平板中长出的菌落                            的三氟乙酸水溶液进行混合制成流动相；等度洗脱，
            数，个。                                               采集信号 20 min。
            1.2.4  DES 诱变致死率曲线的测定                                  采用 HPLC“标准品+样品”法定性分析发酵液
                 取菌株 AN-126 经 ARTP 诱变后得到的 2 mL 孢               中达托霉素。用甲醇溶解达托霉素标准品，得到达
            子悬液加入到 18 mL 磷酸缓冲液（pH 为 7）中，然                      托霉素标品；按上述发酵液处理方法得到发酵液样
            后分别再加入 40、80、120、160、200 µL DES 原液，                品；将标品与样品以体积比 2∶8 混合得到“标准
            使 20 mL 反应体系中 DES 的体积分数分别为 0.2%、                   品+样品”。按上述 HPLC 操作条件分别处理标品、
            0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，30  ℃反应 20 min，反               样品、标准品+样品，分析达托霉素出峰时间，对发
            应结束后加质量分数为 25%的硫代硫酸钠水溶液                            酵液中的物质进行定性分析。
            1 mL 终止反应，以未加 DES 诱变的孢子悬液涂布                        1.2.9   达托霉素产量的测定
            的平板作为对照，制作致死率曲线。                                       用甲醇溶解达托霉素标准品，分别配制质量浓
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