Page 124 - 《精细化工》2023年第9期

·1972· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

度为 20、40、80、140、240、360 mg/L 的达托霉素 液的体积，L。
标品，按照 1.2.8 节 HPLC 操作条件进行标品峰面积 总糖测定：蒽酮比色法 [21] 。
测定，得到峰面积（y）与达托霉素质量浓度（x，mg/L） 氨氮测定：靛酚蓝反应法 [22] 。
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的标准曲线方程为：y=12022x+1.2083，R =0.998。
根据达托霉素的峰面积，代入标准曲线公式，计算 2 结果与讨论
得出达托霉素在发酵液中的产量。
2.1 发酵液中产物分析
1.2.10 高产菌株遗传稳定性测试
发酵培养基成分复杂，加上玫瑰孢链霉菌在发
将复筛得到的高产菌株进行平板传代，传 5 代，
酵过程中会产生除达托霉素以外的其他产物，因此
每代均用 1.2.7、1.2.8 节方法进行达托霉素产量测
有必要对发酵液中的达托霉素进行定性分析。按照
定。
“标准品+样品”法对发酵液中的达托霉素进行定性
1.2.11 高产菌株的形态学特征测试
分析，结果如图 1 所示。
将 AN-126 和高产突变菌株的单孢子悬液稀释
涂布于 DT 平板中，观察菌落形态、孢子颜色、产
孢量以及孢子生长速率。
1.2.12 高产菌株的 BOX-PCR 多态性测试
将原始菌株 AN-126 与高产突变菌株分别接入
装有 20 mL TSB 培养基的 100 mL 锥形瓶中，30 ℃、
250 r/min 培养 2 d。12000 r/min 条件下离心 2 min
离弃上清液，将菌体倒入研钵后加入液氮研磨，之
后用细菌 DNA 抽提试剂盒提取菌株的 DNA，所得
DNA 于–20 ℃保存或直接进行下一步实验。
PCR 反应体系：DNA 模板 1 µL、2X San Taq PCR a—达托霉素标品；b—标准品+样品；c—发酵液样品
图 1 发酵产物的 HPLC 谱图分析
Mix 酶 12.5 µL、引物 2 µL、ddH 2O 补足至 25 µL。
Fig. 1 HPLC analysis of fermentation products
PCR 扩增体系：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变
性 30 s，55 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，30 个 由图 1 可知，达托霉素标品、发酵液样品以及
循环，72 ℃延伸 10 min。 标准品+样品均在保留时间为 5.8 min 左右出现响应
1.2.13 高产菌株 5 L 发酵罐发酵过程 值，表明发酵液中存在达托霉素。
以 10%的接种量将种子液接种到 5 L 搅拌式发 2.2 癸酸钠 MIC 的确定
酵罐，罐中总装液量为 3.5 L，控制发酵温度为 30 ℃， 为考察癸酸钠质量对出发菌株的影响，将出发
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通气量为 0.8 m /h，pH 控制在 7.0。通过转速来调控 菌株 AN-126 的单孢子悬液涂布在含有不同质量浓
溶氧量，发酵开始时溶氧量（DO）设置为 100%， 度的癸酸钠的 DT 平板上，30 ℃培养 8 d，结果见
发酵过程中 DO 控制在 35%左右。发酵开始 30 h 后， 图 2。
开始每隔 6 h 往发酵罐中补加 25 mL 质量浓度为 40
g/L 的癸酸钠水溶液，培养 72 h 后，每隔 12 h 往发
酵罐中补加 25 mL 质量浓度为 40 g/L 的癸酸钠溶液
直至发酵结束。发酵过程中每隔 6 h 取样测定菌体
干重、氨氮含量、总糖含量以及达托霉素产量。
1.2.14 分析方法
菌体干重测定：将滤纸在 85 ℃烘箱中烘干至
恒重，称重后备用。取 10 mL 发酵液，12000 r/min
离心 10 min，去离子水洗涤两次后置于滤纸上过滤，
然后在烘箱中 85 ℃烘干至恒重，按照式（2）计算
单位体积发酵液中菌体干重：

m a—0 g/L；b—2 g/L；c—4 g/L；d—6 g/L；e—8 g/L
M  （2） 图 2 出发菌株在含有不同质量浓度癸酸钠的 DT 平板中
V
式中：M 为单位体积发酵液中菌体干重，g/L；m 为所 生长情况
Fig. 2 Growth of strain AN-126 on DT plate with different
取的发酵液离心烘干后菌体的质量，g；V 为所取发酵 mass concentrations of sodium decanoate