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·496· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

图进行线性拟合，计算 IC 50 值（清除率为 50%时 2 结果与讨论
所需抗氧化剂的浓度）。IC 50 越小，该物质抗氧化性
越强 [13] 。 2.1 咖啡酰氨基酸乙酯的合成
1.4 清除羟基自由基实验 以 EDC 为脱水剂，具有反应速度快，收率高，
采用 Fenton 反应体系参考文献[14]方法测定羟 产物消旋小，选择性好等优点；HOBt 为酰胺缩合剂
基自由基清除活性。用 DMSO 溶液将待测物配制成 用于抑制外消旋作用，但其微溶于水，故采用 DMF
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不同浓度：2.0×10 、2.5×10 、3.0×10 、3.5×10 、 作溶剂。Fan [14] 等采用文献[6]合成方法，以肉桂酸
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4.0×10 、4.5×10 mol/L。取菲啰啉的乙醇溶液 与甘氨酸乙酯盐酸盐为原料合成了肉桂酰甘氨酸乙
（ 0.75 mmol/L ）、磷 酸盐 缓冲液（ 0.2 mol/L ， 酯，产率为 89.5%。本文以咖啡酸及不同氨基酸乙
pH=7.4）、样品溶液、FeSO 4 水溶液（0.75 mmol/L） 酯盐酸盐为原料合成 4 种咖啡酰氨基酸乙酯：咖啡
酰缬氨酸乙酯（Ⅲa）：浅黄色固体，产率：79%，
各 1 mL加入试管中，再加入 1 mL H 2 O 2 水溶液（H 2 O 2
体积分数 0.01%），混匀。37 ℃孵育 1 h，536 nm 下 m.p.136~138 ℃；咖啡酰亮氨酸乙酯（Ⅲb）：浅黄
色固体，产率 82.0%，m.p.64~66℃；咖啡酰蛋氨酸
测定混合物吸光度，计算 IC 50 值。羟基自由基抑制
乙酯（Ⅲc）：白色粉末状固体，产率：75.3%，
率按下式计算。
m.p.160~162 ℃；咖啡酰酪氨酸乙酯（Ⅲd）：白色
I/%=〔(c  b)/(a  b)〕×100
粉末状固体，产率：78.4%，m.p.102~104 ℃。产率
式中：I 为羟基自由基抑制率；b 为空白组吸光度；
大小顺序为：Ⅲb >Ⅲa >Ⅲd >Ⅲc。
c 为实验组吸光度；a 为对照组吸光度。
2.2 咖啡酸酰氨基酸乙酯的结构表征
1.5 红细胞溶血（RBC）实验
–1
Ⅲa：IR (KBr)，v/cm ：3341.21 (N—H)，1738.10
配制 pH=7.4 磷酸盐（PBS）缓冲液（添加葡萄
1
(C==O)，1260.30 (C—O)，1153.27 (C—O)。 HNMR
糖，1.8 g/L）及抗凝剂柠檬酸缓冲液〔柠檬酸三钠
(400 MHz，DMSO-d 6 )，δ：9.37 (s，1H，OH)，9.12
C 6 H 5 Na 3 O 7 2H 2 O （ 0.02 kg/L ），柠檬 酸 C 6 H 8 O 7
(s，1H，OH)，8.18 (d，J=8.1 Hz，1H，NH)，7.23 (d，
（0.008 kg/L）〕。用无菌离心管分装采集的新鲜血液
J=15.7 Hz，1H，HC==C)，6.94 (s，1H，ArH)，6.84
〔新鲜兔血盛装于无菌离心管中，按 V（血液）∶V
(d，J=8.2 Hz，1H，ArH)，6.74 (d，J=8.1 Hz，1H，
（抗凝剂）=1∶9 加入抗凝剂柠檬酸缓冲液，混匀〕，
ArH)，6.53 (d，J=15.7 Hz，1H，C==CH)，4.29~4.22
1500 r/min 离心 15 min 后弃去上清液，加入 PBS 轻
(m，1H，CH)，4.09 (dd，J=6.9、7.0 Hz，2H，OCH 2 )，
摇混洗后再次离心，至上清液为无色透明状。沉淀
2.09~2.03 (m，1H，CH)，1.18 (d，J=7.1 Hz，3H，
部分用 PBS 溶液稀释为体积分数 2%红细胞悬液，
+
CH 3 )，0.91~0.86 (m，6H)。ESI-MS [M+H] ，m/Z:
摇晃均匀，即得 RBC 悬液。样品均用 PBS 缓冲液
实测值（计算值）：308.0713（307）。
稀释至 1 mmol/L（DMSO 助溶）；十二烷基硫酸钠
–1
Ⅲb：IR (KBr)，v/cm ：3347.59（N—H），2959.35
（SDS）（1.3 g/L）作为阳性对照。溶血测定：各浓
(—CH 3 )，2917.89 (—CH 2 )，1720.74 (C==O)，1271.39
度样品溶液与 RBC 悬液按 V（样品）∶V（RBC）= 1
(C—O)，1191.36 (C—O)。 HNMR (400 MHz，
3∶1 添加于离心管中，混匀。用去离子水和 PBS 分
DMSO-d 6 )，δ：9.35 (s，1H，OH)，9.15 (s，1H，
别替代样品按相同体积比添加，作为完全溶血和阴
OH)，8.29 (d，J=7.7 Hz，1H，NH)， 7.24 (d，
性对照，然后室温摇床孵育 1 h。受试物-RBC 混合
J=15.7 Hz，1H，HC==C)，6.94 (d，J=1.5 Hz，1H，
液在 10000 r/min 下离心 1 min。540 nm 处测定其
ArH)，6.84 (d，J=8.2 Hz，1H，ArH)，6.74 (d，J=8.1 Hz，
OD 值。溶血率计算公式如下所示。 1H，ArH)，6.39 (d，J=15.7 Hz，1H，C==CH)，4.36
品 样 OD - 性 阴 OD (d，J=5.3 Hz，1H，CH)，4.08(q，J=7.1 Hz，2H，
溶血率 / %   100
完 OD 阴 性全溶血 OD OCH 2 )，1.66~1.50 (m，3H，CH 2 +CH)，1.17 (t，J=
式中：阴性 OD 为 PBS 与红细胞悬液作用后吸光度 7.1 Hz，3H，CH 3 )，0.88 (dd，J=19.6、6.5 Hz，6H，
值；完全溶血 OD 为去离子水与红细胞悬液作用后 CH 3 +CH 3 )。ESI-MS [M+H] ，m/Z：实测值（计算值）：
+
吸光度值。 322.0833（321）。
1.6 数据分析 Ⅲc：IR (KBr)，v/cm ：3324 (N—H)，2980
–1
实验重复测定 3 次，采用 SPSS 19.0 软件进行 (—CH 3 )，2913 (—CH 2 )，1653 (C==O)，1303 (C—
1
统计学分析。测量数据均以 Mean±S.D.表示，通过 O)。 HNMR (400 Hz，C 3 D 6 O)，δ：7.33~7.22 (m，
方差分析和多组样本间差异显著性进行分析。概率 1H，OH)，6.95 (s，1H，OH)，6.82 (s，1H，NH)，
P<0.05 时，该组数据被认为具有显著性差异。 6.70 (s，1H，HC==C)，6.40 (d，J=15.6 Hz，1H，