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第 4 期                        陈小强，等:  向日葵茎髓提取物的抑菌活性及机制                                    ·651·


            津杯中注入质量浓度为 100  g/L 的样品液 200  μL，                  100、120、140 min 时间点分别取样 5 mL，5000 r/min
            以 DMSO 为空白对照，以青霉素（Penicillin）为阳                    离心 10 min，取上清液，测定其电导率。
            性对照，在 37  ℃的恒温培养箱中培养 16~18 h 后用                    1.2.5    菌悬液碱性磷酸酶（AKP）含量的测定
            游标卡尺测量其抑菌圈直径。                                          实验方法同 1.2.4 节，按照 AKP 试剂盒说明书
                 参考文献[15]方法测定各萃取部位最小抑菌浓                        测定各菌悬液吸光度（OD 值），计算 AKP 含量。
            度（MIC）。向 96 孔板每孔加入空白营养肉汤培养                         1.2.6    菌悬液胞外可溶性蛋白含量的测定
            基 100  μL，再向每排的第一孔中加入质量浓度为                             实验方法同 1.2.4 节，按照考马斯亮兰试剂盒说
            200 g/L 的样品液 100 μL，然后对样品液依次进行 2                   明书测定各菌悬液 OD 值，计算可溶性蛋白含量。
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            倍稀释后向每孔中加入菌落浓度为 1.010  CFU/L                      1.2.7    菌悬液 DNA 含量变化的观测
            的不同受试菌悬液 100 μL，此时每孔样品液终质量                             依据文献[19]方法进行 EE 处理菌悬液的 DAPI
            浓度依次为 50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、              染色观察。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活化培养
            0.39、0.20、0.10 g/L，对照组为 100 μL DMSO+100 μL         至对数期，按体积分数 1%接种量分别接种到 EE 质
            菌悬液，将 96 孔板放入 37  ℃的恒温培养箱中避光                       量浓度为 3.12  g/L 的营养肉汤培养基中，再以相同
            培养 24 h 后，每孔加入体积分数 0.2% TTC 20 μL，                 接种量接种到不含 EE 的营养肉汤培养基中作为对
            继续避光培养 4 h 后，观察颜色变化。                               照，摇床中振荡培养（37  ℃，120 r/min）16~18 h。
                 参考文献[16]方法测定各萃取部位半数抑制浓                        各吸取 2  mL 菌悬液，PBS 清洗 3 次，体积分数为
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            度（IC 50 ）。将菌落浓度均为 1.010  CFU/L 的 4 种              3%的戊二醛磷酸盐缓冲液固定 10  min，吸去固定
            受试菌悬液加入到洁净无菌的 96 孔培养板中，再加                          剂，PBS 清洗 3 次，加入体积分数为 0.2%的 Triton
            入 50  μL 不同浓度梯度的样品液，设置 3 组重复实                      X-100 通透细菌细胞 10 min，吸去 Triton X-100 后，
            验，将 96 孔板放入 37  ℃的恒温培养箱中培养 24 h                    PBS 清洗 3 次，加入 DAPI 染色液，在暗室中染色
            后，于 595 nm 处测定其紫外吸收值（OD）。按下式                       5~ 10 min，最后滴至载玻片上，封片，在荧光显微
            计算抑制率（%）：                                          镜下观察、拍照。
                 抑制率    /% [1 (A＝    A 0 t  ) /(A c  o  n    A 0  )] 100     依据文献[20]方法进行 EE 处理菌悬液的 DAPI
            式中：A 0 为肉汤培养基的 OD 值；A t 为样品液+菌液                    染色荧光强度测定。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌
            的 OD 值；A con 为菌悬液+生理盐水的 OD 值。以样                    活化培养至对数期，按体积分数 1%的接种量分别接
            品液浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘图，得到线                             种到 EE 质量浓度为 3.12 g/L 的营养肉汤培养基中，
            性回归方程，计算当抑制率为 50%时的样品液浓度，                          摇床中振荡培养（37  ℃，120  r/min），分别在 8、
            即 IC 50 值。                                         12、16、20、24、28 h 取样 0.2 mL，加入 3 倍体积
            1.2.3    扫描电镜观察                                    的 DAPI 染色液，混匀后暗室中静置 10 min，在 DNA
                 参考文献[17]方法，取对数生长期的两种菌体，                       的激发波长 358  nm 下，用荧光分光光度计检测菌
            用质量浓度为 3.12 g/L（4 倍最低抑菌浓度，下同）                      体 DNA 的荧光强度，以未经 EE 处理的菌体样液为
            的 EE 分别处理 6  h，用 PBS 浸洗 3 次，加入 4  ℃                对照。
            预冷体积分数为 3%的戊二醛磷酸盐缓冲液（pH                            1.3   统计分析
            7.4）固定，过夜，吸出固定剂，用 PBS 浸洗 2 次，                          每个实验重复 3 次取平均值，结果以均值±标准
            每次 10 min，再用系列梯度酒精（体积分数 30%、                       差（x¯±S）表示。采用 SPSS 20.0 软件进行数据处理，
                                                               利用单因素方差分析和 Duncan 法检验多组数据
            50%、70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每种
            体积分数酒精浸洗 2 次，每次 10 min。在室温下进                       间差异的显著性，利用 Pearson 法进行相关性分
                                                               析，以 P<0.05 表示差异显著，以 P<0.01 表示差异
            行干燥，再用真空喷镀法对样品进行导电处理后即
                                                               极显著。
            制成电镜样品，于 JSM-7500F 扫描电镜下观察菌体
            形态变化，以未经 EE 处理的菌体作为空白对照。                           2    结果与讨论
            1.2.4    菌悬液电导率的测定
                 参考文献[18]方法，取对数生长期且菌落浓度                        2.1    抑菌活性测定
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            约为 1.010  CFU/L 的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌                         天然产物的抑菌效果可通过测定抑菌圈直径来
            的菌悬液置于 96 孔板，向其中分别加入 EE 样品液，                       进行评价，抑菌圈直径越大，说明该物质抑菌效果
            使 EE 质量浓度为 3.12 g/L，空白对照组加无菌水，                     越好。各萃取部位对 4 种受试菌抑菌圈直径大小及
            置摇床中培养（37  ℃）。在 0、20、40、60、80、                     MIC 的影响见表 1。
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