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第 5 期 刘雯恩，等: 优化Ⅰ型胶原蛋白的纯化工艺 ·851·

降解性、止血性等，既可独立使用，又可与其他材 1.2 胶原蛋白的提取与纯化方法
料复合使用 [2-3] ，已被广泛应用于生物医学、美容保 胶原蛋白提取和纯化过程见图 1。
[5]
健 [2-4] 和食品工业等领域 。Ⅰ型胶原蛋白常见提取
[6]
方法有盐提取法、酸提取法 、碱提取法和酶提取
[7]
法等 。盐法与碱法提取的胶原蛋白为胶原蛋白多
肽。酶法提取有较好的专一性，特别是胃蛋白酶可
选择性地将胶原蛋白两端非螺旋结构的端肽降解除
去，这些端肽被认为是产生免疫原反应的物质基础。
使用胃蛋白酶提取可保持Ⅰ型胶原蛋白三螺旋结构
[8]
的稳定性，又可降低胶原蛋白免疫原性 。Ⅰ型胶
原蛋白不溶于水，但可溶于稀醋酸溶液，故采用酸
酶结合提取法较为适用。由于胶原蛋白在 38 ℃以
[9]
上容易变性，因而提取操作尽量低温 。
胃蛋白酶蛋白相对分子质量大小在 35~55 kDa，

会刺激眼睛、呼吸系统和皮肤，是一种过敏源，纯 图 1 胶原蛋白提取和纯化过程图
化胶原蛋白的过程中需将其清除。胃蛋白酶与胶原 Fig. 1 Collagen extraction and purification process

蛋白长期作用，会导致胶原蛋白裂解为胶原蛋白肽
将 500 g 牛跟腱冷冻切片，用体积分数 75%乙
甚至小分子质量的氨基酸。为消除胃蛋白酶的影响，
醇溶液浸泡 6 h 脱脂消毒，用水冲洗干净，粉碎，
通常通过盐析或加热失活胃蛋白酶。但盐析会引入
按固液比 1∶60（g/mL）分散于 0.5 mol/L 醋酸-胃
氯离子，增加后期纯化胶原蛋白的困难，加热操作 蛋白酶溶液中〔m(牛跟腱)∶m(胃蛋白酶)=1∶0.03〕，
步骤会加大胶原蛋白变性的风险，进而破坏了胶原 使用冷循环装置在 10 ℃以下进行酶解提取，提取
蛋白的结构及功效。 过程中缓慢搅拌。72 h 后，提取液于 4 ℃左右
Ⅰ型胶原蛋白的相对分子质量约为 300 kDa， 8000 r/min 离心 5 min，收集上清液，进入纯化阶段。
可被半透膜截留，一些小分子杂质可以从半透膜穿 首先，采用等电点沉淀法去除胃蛋白酶：往上清液
过从而达到分离纯化效果。但这一纯化过程周期长， 中缓慢加入 1 mol/L 氢氧化钠溶液，缓慢搅拌，调
需 7 d 左右 [10-11] ，容易滋生微生物，不利于工业化 节溶液的 pH 至 5.8~7.0，可观察到胶原蛋白沉淀析
生产。本文采用等电点沉淀法，可以快速有效清除 出。静置 2 min，过滤，纯水快速清洗胶原蛋白沉淀
胶原蛋白溶液中的胃蛋白酶；使用超滤纯化技术， 物 3~4 次，即得Ⅰ型胶原蛋白粗提取物 [12] 。
可得到高纯度的Ⅰ型胶原蛋白 [12-13] 。 将粗提物溶于 0.5 mol/L 醋酸配制成 1 g/L 胶原
蛋白溶液，在一定压力下进行超滤纯化柱层析 [13] ，
1 实验部分 纯化层析柱截留相对分子质量为 100 kDa，超滤纯
化过程中压力保持在 0.8 MPa 以下。为保证胶原蛋
1.1 材料与仪器
白的稳定性，尽量使用温度保持 4 ℃的冷循环装置。
牛跟腱、胃蛋白酶，浙江崇山生物制品有限公
纯化过程中，不断加入纯化水，直至纯化后的胶原
司提供；冰醋酸、考马斯亮蓝 R-250、硫酸铜氢氧
蛋白液 pH≈5，即得到高纯度胶原蛋白液。
化钠，AR，天津市大茂化学试剂厂；体积分数 75%
1.3 纯化过程中胃蛋白酶残留量检测
乙醇溶液，德州安捷高科消毒制品公司；Ⅰ型胶原
1.3.1 鞣酸沉淀法
蛋白，SLBQ7099V，美国 Sigma 公司； 取Ⅰ型胶原蛋白析出后的滤液和纯水清洗后的
GL-10MD 大容量高速冷冻离心机，湘仪公司； 水洗滤液，分别加入 50 g/L 鞣酸溶液（5 g 鞣酸纯水
FD-1-50 真空冷冻干燥机，北京博康公司；UV-6000PC 溶解，纯水定容至 100 mL），观察是否有沉淀生成。
紫外分光光度计，上海元析公司；PowerPacTM 通 1.3.2 SDS-PAGE 凝胶电泳法
用电泳仪，Bio-Rad 公司；HYP-3 智能消化炉、KDN- 分别按表 1 和表 2 的配方依次加入，分别配制
812 定氮仪蒸馏装置，上海纤检公司；WQF-510A 出体积分数为 5%浓缩胶和体积分数为 10%分离胶，
傅里叶变换红外光谱仪，北京端利分析公司； 进行恒压电泳，电压为 80 V，待溴酚蓝跑至胶底处
Chirascan 圆二色谱仪，英国应用光物理公司；超滤 停止电泳。将分离胶放入考马斯亮蓝 R-250 溶液中
纯化柱，截留相对分子质量 100 kDa，东莞市方途 染色 30 min，采用乙酸-乙醇脱色液进行脱色至分离
生物科技有限公司。 胶背景色为透明。