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·852·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

                     表 1    体积分数 10%分离胶的配方                     业标准 YY/T  1511—2017 中的附录 A。精密称取样
               Table 1    Preparation formula of 10% separation gel   品 10 和 80 mg 分别进行样品消化和非蛋白氮消化，
                       Reagent               Volume/mL         测定出样品中总氮含量（A 1 , mg/mg）和非蛋白氮含
                    Deionized water            1.9
                                                               量（A 2 , mg/mg）。根据下式计算样品中蛋白质含量。
                       Acr/Bis                 1.7
                                                                    样品中蛋白质含量/%=(A 1 A 2 )5.55100
                   1.5 mol/L Tris-HCl          1.3
                                                               1.5    ú型胶原蛋白的结构表征
                      10 g/L SDS               0.05
                                                               1.5.1    SDS-PAGE 实验
                      100 g/L AP               0.05
                                                                   配制Ⅰ型胶原蛋白液，质量浓度为 1 g/L，参照
                       TEMED                   0.002
                                                               1.3.2 节进行电泳实验。
                 TEMED：四甲基乙二胺，下同。                              1.5.2    傅里叶变换红外光谱

                      表 2    体积分数 5%浓缩胶的配方                         将纯化后的Ⅰ型胶原蛋白冷冻干燥，剪碎，与
                Table 2    Preparation formula 5% concentrated gel   溴化钾共同研磨成细粉状并压片后，用傅里叶变换
                       Reagent              Volume/mL          红外光谱仪对样品进行红外扫描，扫描范围为
                                                                          1
                    Deionized water            2.05            500~4400 cm 。
                       Acr/Bis                 0.5             1.5.3    圆二色谱法(Circular Dichroism, CD)
                   1 mol/L Tris-HCl            0.38                将纯化后的胶原蛋白溶液稀释成 1 g/L，将此溶
                     10 g/L SDS                0.03            液样品加入石英池，在 180~260  nm 内进行波长扫
                     100 g/L AP                0.03            描，每个数据点间隔为 1 nm  。
                       TEMED                   0.003
                                                               2   结果与讨论
                 Acr/Bis：丙烯酰胺（Acr）29 g，甲叉双丙烯酰
                                                               2.1   纯化过程中胃蛋白酶的残留量检测
            胺（Bis）1 g，超纯水定容至 100 mL，37 ℃下溶解，
                                                               2.1.1    沉淀法
            0.45 m 滤膜过滤，4 ℃避光保存，使用时恢复室温
                                                                   蛋白质属于两性物质，当其 pH 处于等电点时，
            且无沉淀。1.5  mol/L  Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷
                                                               分子表面净电荷为零，蛋白分子间的静电排斥作用
            （Tris，M W  121.14）18.16  g，超纯水 80  mL，溶解
                                                               减弱，吸引力增大，蛋白分子聚集发生沉淀。采用
            后，用盐酸调 pH 至 8.8，最后用超纯水定容至                          等电点沉淀法进行测试，蛋白质的回收率较高，并
            100 mL，高温灭菌后室温下保存。1 mol/L Tris-HCl：                可有效清除中性脂肪         [14] 。
            12.1 g Tris 用超纯水 80 mL 溶解后，用盐酸调 pH 至                   胃蛋白酶可切除胶原蛋白非螺旋结构区域的过
            6.8，最后用超纯水定容至 100 mL，高温灭菌后室温                       敏端肽，不破坏三螺旋结构。若将残留有胃蛋白酶
            下保存。10 g/L SDS（十二烷基硫酸钠）：电泳级的                       的胶原蛋白制成产品容易出现颜色发黄等现象，并
            SDS 1 g，超纯水 80 mL，68 ℃加热溶解，滴加数滴                    伴有刺激等不良反应，应尽量清除胶原蛋白中的胃
            盐酸调节 pH 至 7.2，定容至 100 mL，室温保存。100                  蛋白酶。多次预实验发现，调节溶液的 pH 在 5.8 以
            g/L AP（过硫酸铵）：过硫酸铵 0.1 g，超纯水 1.0 mL，                上，接近胶原蛋白等电点时，胶原蛋白即絮凝沉淀。
            少量配制20 ℃储存。使用时在 4 ℃保存，保存时                         由于胃蛋白酶亲水性较强，在水中的溶解度较大，
            间约为 2 周。                                           根据溶解度的差异，多次快速水洗可除去胃蛋白酶。
            1.4    ú型胶原蛋白的纯度分析                                 胃蛋白酶与鞣酸结合会出现白色沉淀，根据这一性
            1.4.1    纯化与未纯化胶原蛋白的 SDS-PAGE 电泳                   质，可以判断胃蛋白酶是否残留。
                   实验                                              使用 1 mol/L 氢氧化钠溶液，调节 pH 到胶原蛋
                 配制纯化和未纯化的胶原蛋白溶液，质量浓度                          白的等电点时，胶原蛋白析出，取滤液加入 50  g/L
            为 1  g/L，将纯化的胶原蛋白作为样品，按照 1.3.2                     鞣酸溶液，出现大量白色浑浊，说明胶原蛋白沉淀
            节进行电泳实验。                                           后的滤液中含有较高浓度的胃蛋白酶（如图 2a 所
            1.4.2    紫外光谱测定                                    示）；第 1 次和第 2 次水洗胶原蛋白后的滤液加入
                 将Ⅰ型胶原蛋白液用 0.5  mol/L 醋酸稀释至质                   50 g/L 鞣酸溶液后，白色沉淀逐渐减少（如图 2b、
            量浓度约 0.5 g/L，醋酸溶液作为空白对照，利用紫                        c 所示），第 3 次水洗胶原蛋白后，水洗滤液与鞣酸
            外-可见分光光度计进行全波长扫描。                                  反应后，已观察不到絮状沉淀，肉眼判断如纯净水
            1.4.3    蛋白含量测定                                    清澈（如图 2d、e 所示）。所以，经 3 次清洗可基本
                 采用凯氏定氮法，参照中华人民共和国医药行                          除去胃蛋白酶。
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