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第 5 期 刘雯恩，等: 优化Ⅰ型胶原蛋白的纯化工艺 ·853·
盐析的较佳工艺为：氯化钠浓度 3 mol/L，盐析时间
为 36 h，透析除盐时间不少于 7 d。由于常规透析方
法纯化胶原蛋白周期长，不利于产业化生产；根据
透析原理，本文将超滤纯化技术用于Ⅰ型胶原蛋白的
纯化，纯化原理示意图如图 4 所示。选用中空纤维超
滤膜代替透析袋（膜截留相对分子质量为 100 kDa），
在一定压力下（0.8 MPa 以下）胶原蛋白溶液循环通
过超滤纯化柱 [13] ，酸、水、各种离子及小分子物质
a—Ⅰ型胶原蛋白沉淀后的滤液；b—第 1 次洗涤滤液；c—第 2
次洗涤滤液；d—第 3 次洗涤滤液；e—纯净水 从纤维膜孔隙流出，Ⅰ型胶原蛋白相对分子质量较
图 2 向不同水洗滤液中加入 50 g/L 鞣酸溶液后照片 大，一直保留在纤维膜内。与传统的透析处理方法
Fig. 2 Chemical reaction diagram of 50 g/L tannic acid 相比，超滤纯化技术通过动力输送，循环过程加速，
solution with pepsin 纯化周期可由透析处理的 7 d 缩短至 1 d，避免了纯
2.1.2 SDS-PAGE 法 化过程中细菌滋生的可能，提高了生产效率。
为验证胃蛋白酶是否清除干净，作者还采用
SDS-PAGE 法进行了验证。图 3 为不同水洗滤液及
胃蛋白酶溶液的 SDS-PAGE 图。不同质量浓度的胃
蛋白酶溶液（3、0.3 和 0.03 g/L），在相对分子质量
35~55 kDa 内有两条位置相同的条带。Ⅰ型胶原蛋
白沉淀后的滤液和第 1 次洗涤滤液出现条带（图 3a、
b）表明，滤液及水洗液中含有一定量胃蛋白酶。从
图 3c 中可知，第 2 次洗涤滤液没有出现胃蛋白酶的
特征条带，说明胃蛋白酶的残留量较低。第 3 次洗
涤滤液（图 3d）没有出现胃蛋白酶的条带，与上述
鞣酸沉淀法检测洗涤滤液中是否存在胃蛋白酶的结 图 4 超滤纯化作用示意图
Fig. 4 Schematic diagram of ultra-filtration purification
果一致，均可证明胃蛋白酶已基本清除干净。
2.2.1 超滤纯化前后胶原蛋白的 SDS-PAGE
胶原蛋白溶液超滤纯化前后的 SDS-PAGE 图
谱，如图 5 所示。超滤纯化前的胶原蛋白溶液在 SDS-
PAGE 谱图上有多条小分子蛋白条带，对应多种小
分子杂蛋白，此时的胶原蛋白纯度不太高；但经超
滤纯化后，电泳图谱上仅出现了 100 kDa 以上的谱
带，很明显超滤纯化技术可有效清除胶原蛋白溶液
中的小分子杂蛋白。
2.2.2 Ⅰ型胶原蛋白紫外光谱
Ⅰ型胶原蛋白的紫外光谱分析结果见图 6。牛
跟腱中提取的胶原蛋白（homemade）在 190~300 nm
a—Ⅰ型胶原蛋白沉淀后的滤液；b—第 1 次洗涤滤液；c—第 2 处有紫外吸收，由于Ⅰ型胶原蛋白中具有含苯环结
次洗涤滤液；d—第 3 次洗涤滤液 构的羟脯氨酸和脯氨酸，使其最大紫外吸收峰在
图 3 不同水洗滤液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
Fig. 3 SDS-PAGE diagram of different washed filtrates 235 nm 处，这与文献报道的Ⅰ型胶原蛋白的紫外吸
收特征峰相符 [16-17] 。与标准Ⅰ型胶原蛋白（标样）
2.2 ú型胶原蛋白纯度分析 的最大紫外吸收峰位置（235 nm）一致。
工业化生产中一般采用加入氯化钠进行盐析来 2.2.3 蛋白含量测定
初步纯化胶原蛋白，由于盐析法引入氯离子，故常 YY/T 1511—2017 中规定采用凯氏定氮法测定
结合透析法获得高纯度Ⅰ型胶原蛋白。将一定浓度的 干燥后的胶原蛋白中蛋白的质量分数不小于 90%。
胶原蛋白溶液装入透析袋内，封口，并浸入水或缓冲 本文将超滤纯化后的胶原蛋白冷冻干燥，按标准规
液中，不断更换洗脱液，盐、水和小分子物质不断扩 程操作，其蛋白质量分数达到 94.35%，如表 3 所示，
散透析到袋外，从而达到纯化目的。有研究证实 [15] ， 所以其纯度已经达到行业标准。
