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·858· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

后，吸取 100 μL 菌种液均匀涂于平板，培养温度 及最佳响应值结果。
30 ℃，培养 72 h 后，挑取大小适中的单菌落均匀涂 1.2.4 发酵培养基中 OD 的测定
于斜面培养基中，培养温度 30 ℃，培养 48 h 后， 取培养结束的发酵液，超声振荡 30 min 后，
用 10 mL 无菌水将斜面培养基上的菌落洗脱于无菌 用移液管取 2.5 mL 置于 25.0 mL 容量瓶中，并向
水中，再吸取 1 mL 菌落洗脱液接种于种子培养基 25.0 mL 容量瓶中加入去离子水，定容至 25.0 mL，
中，作一级种子培养，培养温度 30 ℃，装液量 50 并摇匀。随后，取稀释 10 倍的菌液 1.0 mL，置于可
mL/250 mL，摇床转速 250 r/min，培养时间 24 h； 见分光光度计中，在波长 600 nm 的条件下，进行吸
一级种子培养 24 h 后，将一级种子液按体积分数 5% 光度值的测定，从而得出发酵液中菌体的 OD 值。
转接于二级种子瓶中，培养条件与一级种子培养条 1.2.5 发酵产量的测定
件一致，二级种子培养 24 h 后，将二级种子液按体 取 1 mL 待测样品和 9 mL 含有体积分数 0.5%
积分数 5%接种至摇瓶发酵培养基中，培养温度 甲酸的甲醇溶液，混合均匀装入 10 mL 试管超声处
30 ℃，装液量（体积分数）20%，转速 250 r/min， 理 30 min，待其结束取混合液 1 mL，进行高速离心
培养时间 72 h 后，结束发酵，对发酵液进行相应的 5 min，转速 12000 r/min，离心结束取上清液再次经
产量检测处理。 0.2 μm 膜过滤获得待测样品。采用 Shim-pack VP-
1.2.2 单因素实验方法 ODS 色谱柱 (250 mm ×4.6 mm, 5 μm)进行梯度洗
以青蒿酸发酵产量作为指标，分别考察发酵温 脱（程序见表 1），流动相为 1500 mL 0.1%（体积分
度（24、26、28、30、32、34 ℃）、发酵初始 pH（3.5、 数）磷酸水溶液与 2885 mL 乙腈混合溶液（A）和
4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）、半乳糖质量浓 95%（体积分数）乙腈水溶液（B），分析时间为 25
度（3.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 g/L）、不同碳 min，流速为 1.2 mL/min，进样量为 10 μL，检测波长
源（葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖， 为 212 nm，柱温为 40 ℃ [10] 。
质量浓度 40 g/L）、不同有机氮源（蛋白胨、酵母粉、
表 1 梯度洗脱程序
玉米浆、谷氨酸钠、尿素，质量浓度 15 g/L）、不同
Table 1 Gradient elution procedure
无机氮源（硫酸铵 15 g/L、硝酸钠 19.3 g/L、硝酸铵
t/min (A)/% (B)/%
9.1 g/L、硝酸钾 22.9 g/L）对酿酒酵母工程菌 S.
0.01 40 60
cerevisiae 1211 发酵产青蒿酸的影响。
3 40 60
1.2.3 响应面法优化发酵培养基
10 20 80
本研究主要拟通过以下 3 部分达到最优结果。 13 3 97
（1）Plackett-Burman 实验：采用 Plackett-Burman 17 3 97
实验分析培 养基各成分 对酿酒酵母 工程菌 S. 18 30 70
cerevisiae 1211 发酵产青蒿酸的影响，找出对青蒿酸 22 30 70
发酵影响最为重要的因素 [18] 。用 Minitab 软件进行 22.5 40 60
实验设计和结果分析，用多线性回归模型逐步回归 25 40 60
法拟合各因素与响应值之间的线性方程。拟合方程
为： 2 结果与讨论
0 Y   1   1 X  2  2 X   n  n X
式中：Y 为响应值，青蒿酸产量，mg/L; X 1 、X 2 、 2.1 发酵培养条件的单因素实验
X 3 、 …、X n 为影响因子；β 0 为截距；β 1 、β 2 、…、 2.1.1 培养温度对 S. cerevisiae 1211 发酵产青蒿酸
β n 为系数；n 为影响因素数。 的影响
（2）最陡爬坡实验：首先，根据 Plackett-Burman 温度是酿酒酵母工程菌培养过程中较为重要
实验拟合方程系数大小，确定最陡爬坡实验的步长， 的环境因素，培养温度的高低直接影响着酵母菌体
系数越大变化步长越小；其次根据拟合方程系数符 内多种代谢酶的活性，从而影响菌体的正常生理代
号确定各因素影响的作用，“+”为正影响，反之，“－” 谢功能 [21] 。在本研究中，选择一个最优的温度有助
为负影响，从而确定爬坡方向 [19] 。 于酿酒酵母工程菌的快速生长及青蒿酸的高产。因
（3）Box-Behnken 实验：根据 Plackett-Burman 此考察温度对 S. cerevisiae 1211 发酵产青蒿酸的影
和最陡爬坡实验结果，用 Design-Expert V8.0.6 软件 响，在初始培养基（见 1.1.3）基础上，其他培养条
设计 Box-Behnken 实验和分析结果 [20] 。分析响应面 件同 1.2.1 发酵摇瓶培养条件，其发酵培养结果如
回归模型的结果，根据结果得到各因素的最佳水平 图 1 所示。