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第 5 期                      于文文，等:  酿酒酵母工程菌发酵产青蒿酸的工艺优化                                    ·857·


            蒿素及其衍生物在其他疾病的治疗中也显示出诱人                             因）和 ALDH1（青蒿醛脱氢酶基因）整合到酵母体
                                                  [4]
            的前景，因此，青蒿素市场前景非常广阔 。                               内，通过过表达 tHMGR（部分片段删除的 HMG-CoA
                 目前，青蒿素的制备主要有 3 种方法：第一种                        还原酶）和 ERG20（法尼基焦磷酸合酶）基因增加
            是从植物青蒿中提取，该方法受气候、地域的影响                             酵母体内半萜类物质共同前体——法尼基焦磷酸
                           [5]
            大，产量不稳定 ；第二种是通过化学全合成获得，                            FPP  的积累量，并通过进一步过表达酿酒酵母 MVA
            该法需要用到有毒有害试剂且工艺难度极大，成本高                            路径基因和 ADS（紫橞槐二烯合酶）基因，抑制鲨
            昂 [6-7] ；第三种是利用基因工程手段改造的微生物发                       烯合酶表达，实现青蒿二烯的大量合成，再导入外
            酵青蒿酸，再通过化学合成最终获得青蒿素                      [8-12] ，  源基因 CYP71AV1（细胞色素 P450 酶基因），从而
            该法因不受地域及季节限制，且工艺较为简单，因                             最终实现青蒿酸的微生物合成，在上述基因改造过
                                                               程中，分别使用诺尔斯霉素、遗传霉素和潮霉素 B
            此受到广泛关注。2013 年，WHO 也批准了该工艺
            生产的青蒿素应用于临床            [13] 。                      3 种抗生素进行基因转入或敲除的定向抗性筛选，从
                                                               而获得目标菌株。具体菌种构建方法参考文献[9-10]。
                 青蒿酸的微生物发酵技术由 Keasling  教授及
                                                               该菌种现保存于本实验室。除特别说明外，实验所
            其团队首创。2003 年，Keasling 团队实现了酿酒酵
                                                               用试剂均为分析纯。
            母甲羟戊酸（MVA）途径在大肠杆菌体内的表达，
                                                               1.1.2    仪器及设备
            并通过进一步引入紫橞槐二烯合成酶 ADS 基因，实
                                                                   称量天平，上海精密科学仪器有限公司；YM
            现青蒿素重要中间物质——紫橞槐二烯在微生物体
            内的合成，且产量高达 27.4  g/L          [14] 。之后，他们又         型立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公
                                                               司；超净工作台，苏州苏净集团安泰空气技术有限
            从植物黄花蒿中克隆出 P450 氧化酶 CYP71AV1 及
                                                               公司；实验室恒温培养摇床，上海百典仪器设备有
            相关元件，并通过基因工程技术将其整合到酿酒酵母
            体内，使得紫橞槐二烯在酵母体内氧化为青蒿酸                     [9-10] 。  限公司；高效液相色谱仪，美国 Waters 公司；pH
                                                               计，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；721N 型
            但是，Keasling 团队的研究中依然存在青蒿酸发酵
                                                               可见分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司；
            成本高而导致最终青蒿素成本偏高的问题，且并没
                                                               SCQ-200 型超声波清洗器，上海声谱超声波设备厂；
            有对青蒿酸的发酵工艺及培养基进行系统优化的报                             微量移液枪，德国 Eppendorf 公司。
            道。而国内的研究主要集中在通过对菌种的基因工                             1.1.3    培养基
            程改造    [15] ，实现紫橞槐二烯的微生物合成，但尚未                         种子培养基：葡萄糖 19.5 g/L，(NH 4) 2SO 4 15 g/L，
            实现青蒿酸的体内合成           [16-17] ，青蒿素的大规模及低
                                                               KH 2 PO 4  8 g/L，MgSO 4 7H 2 O 6.2 g/L，维生素溶液
            成本获得仍有较大难度。
                                                               12  mL/L，金属离子溶液 10  mL/L，CuSO 4 5H 2 O
                 综上所述，虽然利用基因工程菌发酵产青蒿酸
                                                               40 μg/L，琥珀酸缓冲液 100 mL/L（琥珀酸缓冲液配
            再化学合成青蒿素的制备技术，具有植物提取和化
                                                               制浓度 0.5 mol/L, pH=5.0）。
            学全合成不可比拟的优点，但是，酿酒酵母基因工
                                                                   固体培养基为：种子培养基的基础上外加 20 g/L
            程菌产青蒿酸的发酵工艺及培养基仍需系统性的优
                                                               的琼脂。
            化研究。为了进一步提高青蒿酸的发酵产量，本文
                                                                   摇瓶发酵培养基：葡萄糖 40 g/L，半乳糖 5 g/L，
            以可产青蒿酸的酿酒酵母工程菌 Saccharomyces
                                                               (NH 4 ) 2 SO 4  15 g/L，KH 2 PO 4  8 g/L，MgSO 4 7H 2 O 6.2
            cerevisiae 1211 为发酵菌株，旨在通过对 S. cerevisiae
                                                               g/L，维生素溶液 12 mL/L，金属离子溶液 10 mL/L，
            1211 产青蒿酸的适宜发酵温度、pH、碳源和氮源等
                                                               CuSO 4 5H 2 O 24 mg/L，蛋氨酸 255 mg/L，琥珀酸缓
            关键影响因 素进行了筛 选，从而确 定适合 S.
                                                               冲液 100  mL/L（琥珀酸缓冲液配制浓度 0.5  mol/L,
            cerevisiae 1211 产青蒿酸的最佳发酵工艺、实现青蒿
                                                               pH=5.0）。
            酸产量的提高、降低成本，从而为青蒿素的连续化、
                                                                   其中，金属离子溶液成分为：ZnSO 4 7H 2 O 5.75
            绿色清洁化生产奠定坚实的基础。
                                                               g/L；MnCl 2 4H 2 O 0.32 g/L；CoCl 2 6H 2 O 0.47 g/L；
            1   实验部分                                           NaMoO 4 2H 2 O  0.48  g/L ； CaCl 2 2H 2 O  2.9  g/L ；
                                                               FeSO 4 7H 2 O 2.8 g/L；0.5 mol/L EDTA 80 mL/L。
            1.1    材料与仪器                                           维生素溶液成分为：生物素 0.05 g/L；泛酸钙
            1.1.1    菌种与试剂                                     1 g/L；烟酸 1 g/L；肌醇 25 g/L；维生素 B1 1 g/L；
                 所用菌种为经基因工程手段构建的可发酵产青                          吡哆醛 1 g/L；对氨基苯甲酸 0.2 g/L。
            蒿酸的酿酒酵母工程菌 Saccharomyces cerevisiae                1.2   方法
            1211，该菌种是以酿酒酵母作为底盘生物，将甲羟                           1.2.1    菌种的培养方法
            戊酸途径（MVA）基因、ADH1（青蒿醇脱氢酶基                               将80 ℃冻存的菌种用甘油管取出，快速复苏
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