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第 6 期 张喜峰，等: 螺旋藻多糖铁（Ⅲ）配合物的制备、抗氧化及淋巴细胞增殖活性 ·1099·

1.4 SP-Fe（Ⅲ）体外抗氧化性评价 除能力测定。
1.4.1 DPPH•清除能力 1.4.5 脂质过氧化抑制活性测定
参考文献[18]，略作修改，将 DPPH•标准品采 参考文献[22]的方法，分析 SP 和 SP-Fe（Ⅲ）
用甲醇配制一定浓度梯度，在 517 nm 处测定吸光度 对脂质过氧化抑制活性。
值，以 X 为吸光度值，Y 为 DPPH•质量浓度(g/L)绘 1.4.6 SP-Fe（Ⅲ）在模拟人工胃肠液中 Fe（Ⅲ）释
制标准曲线。按照以下公式计算 DPPH•的清除率。 放量测定
 ρ (DPPH )   参考文献[23]的方法，略作改动。人工胃液：
DPPH清除率 / %   1 t   100 （2） 将 16.4 mL 稀 HCl 和 10 g 胃蛋白酶加水搅拌溶解后，
 ρ (DPPH )   t 0 
定容至 1 L。其中，稀 HCl 为 234 mL 浓 HCl 加水
式中：ρ(DPPH•) t=0 表示 DPPH•最初浓度，g/L，ρ
稀释至 1 L。人工肠液：即磷酸盐缓冲溶液（含胰酶）
(DPPH•) t 表示 t 时刻时，DPPH•的浓度，g/L。
（pH 6.8），取 K 2 HPO 4 6.8 g，加水 500 mL 使其溶
以样品浓度对 DPPH•清除率作图，可得样品对
解，采用 0.1 mol/L NaOH 水溶液调节 pH 至 6.8；另
DPPH•清除率达 50%所对应的样品浓度，即半数有
取胰酶 10 g，加水适量使其溶解，将两液混合后，
效浓度（EC 50 ）。反应在室温条件下进行，清除时间
加水稀释至 1000 mL 即得。将一定量 SP-Fe（Ⅲ）
为 30 min。
置于 1000 mL、pH 2.0 人工胃液中 2 h，然后转移至
1.4.2 2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺
pH 6.8 人工肠液中 3 h，整个反应均在 37 ℃下进行，
盐清除能力
2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐 每间隔 20 min 取样，经 0.45 μm 滤膜过滤后，采用
+
（ABTS •）测定参考文献[19]，并略作改动。将浓 邻菲啰啉分光光度法 [24] 测定 SP-Fe（Ⅲ）中 Fe（Ⅲ）
+
–3
度为 7.4×10 mol/L 的 ABTS •水溶液与浓度为 2.6× 的释放量。
–3
10 mol/L 的高硫酸钾水溶液等体积混合后，在室温 1.4.7 淋巴细胞增殖测定
将生长 6 周后雌性癌症研究所（ICR）小鼠（体
下避光放置 12 h，用体积分数为 95%的乙醇稀释至
+
734 nm 吸光度值为（0.7±0.02），形成 ABTS •工作 重在 18~20 g）处死后，无菌取出其脾脏，收集脾细
6
+
液；取 ABTS •工作液 0.8 mL，加入不同浓度样品 胞悬液并调整细胞浓度为 510 个细胞/mL，加入
溶液 0.2 mL，混匀后静置 6 min，在 734 nm 处测定 96 孔细胞培养板中，除对照组外，其余均加入一定
+
吸光度值，记为 A；取 ABTS •工作液 0.8 mL，加入 浓度梯度 SP 和 SP-Fe（Ⅲ） 100 μL，置于 37 ℃、
体积分数为 95%乙醇 0.2 mL，混匀后静置 6 min， 体积分数为 5% CO 2 培养箱中培养 72 h 后，每孔加
在 734 nm 处测定吸光度值，记为 A 0 ，采用同浓度 入质量浓度为 5 g/L MTT 30 μL，继续培养 4 h 后，
V C 代替样品溶液作阳性对照，按下述公式计算 2000 r/min 离心 10 min，除去上清液，每孔加入 100
+
ABTS •清除率。 μL DMSO 振荡混匀，采用自动酶标仪在 570 nm 测

0
ABTS 清除率 / %  A  A  100 （3） 定其吸光度值，按照以下公式计算其刺激指数（SI）。
A 0 SI  A 1 （5）
1.4.3 •OH 清除能力 A 0
参考文献[20]的方法测定 SP 和 SP-Fe（Ⅲ）清 式中：A 1 为药物组平均吸光度值；A 0 对照组平均吸
除•OH 的能力。取一定浓度范围内样品溶液各 光度值
1 mL，加入 1 mL 0.009 mol/L 的硫酸亚铁水溶液充
分混合，1 mL 0.009 mol/L 水杨酸水溶液和 0.05 mL 2 结果与讨论
0.009 mol/L H 2 O 2 水溶液。在 37 ℃水浴 30 min 后，
2.1 SP-Fe（Ⅲ）中 Fe（Ⅲ）质量分数测定
在 510 nm 处测量混合物的吸光度。按照以下公式计
按照 1.2.3.2 节方法对 SP-Fe（Ⅲ）中 Fe（Ⅲ）
算•OH 清除率。
进行测定，其质量分数为 16.42%±1.17%。
( A  A )A 
 OH清除率 / %  0 1 2  100 （4） 2.2 SP-Fe（Ⅲ）结构表征
A 0 SP 和 SP-Fe（Ⅲ）的红外光谱结果见图 1。
式中：A 0 为反应体系中蒸馏水代替样品溶液时的吸 由图 1 可知，SP 具有多糖典型特征吸收峰
光度值；A 1 为含样品反应体系吸光度值；A 2 为单独 （3382.05、2927.90、1726.42、1639.20、1375.96、
–1
样品溶液吸光度值。 1244.83、1026.43 cm ）。与 SP-Fe（Ⅲ）红外光谱
–
1.4.4 O 2 •自由基清除能力 相比，二者红外图谱主要吸收峰未发生明显改变，
–
参考 Marklund [21] 等的方法，对样品进行 O 2 •清 说明 Fe（Ⅲ）与 SP 结合未破坏多糖结构 [24] 。