Page 85 - 精细化工2019年第8期

第 8 期 李丽丽，等: 柠檬桉树脂总黄酮的提取纯化及抗氧化活性 ·1573·

液的体积，mL；M 为柠檬桉树脂粗提物的质量，g。 压浓缩得到二甲基甲酰胺萃取物，再用氯仿萃取二
1.6.1 分析方法的精密度考察 甲基甲酰胺萃取物的水溶液得到纯化物 D。总黄酮
[5]
考察紫外分光光度分析方法在相同条件下重复 的质量分数按式（2）计算 。
多次测定所得结果与均值间的符合程度，尽可能减 质量分数/%=(m 1 /m 2 )×100 （2）
少实验误差，使得实验更准确 [31] 。准确移取同一体 式中：m 1 为样品总黄酮的质量，mg；m 2 为样品的
积、同一浓度的同一柠檬桉树脂粗提液 5 份，显色 总质量，mg。
后，测其吸光度，平行 3 次，取平均值，计算 RSD。 1.8 柠檬桉树脂总黄酮的抗氧化活性测定
经计算，精密度 RSD=0.97%<5%，表明紫外分光光 1.8.1 清除 DPPH·活性测定
度分析方法的精密度良好。 采用 DPPH·法 [34] 测定不同质量分数总黄酮对
1.6.2 分析方法的稳定性考察 DPPH·的清除活性，在 517 nm 处测定吸光度。每个
将样品溶液放置一段时间再检测其吸光度，测 浓度平行测定 3 次，取平均值。以抗坏血酸、芦丁
定随着时间变化吸光度是否变化，从而检测该方法 作为对照，以蒸馏水为空白。DPPH·清除率的计算
的可靠性 [31] 。准确移取 1 份粗提液 2 mL，显色后， 公式如下。
每隔 10 min 测一组吸光度值，平行 3 次，取平均值。  A  A 
清除率 /%  1  1 2   100 （3）
经计算，稳定性 RSD=0.49%<5%，可见在较长时间  A 0 
内，吸光度值基本不变，说明紫外分光光度法测定 式中：A 0 为 DPPH·的吸光度；A 1 为样品对 DPPH·作
总黄酮含量结果稳定可靠。 用后的吸光度；A 2 为样品自身的吸光度。
1.6.3 分析方法的重复性 1.8.2 总抗氧化活性测定
为检测该分析方法的稳定性，进行重复性实验 [32] 。 采用磷钼试剂法 [35] 对不同质量分数总黄酮的总
准确量取 5 份同一批粗提液 2 mL，显色后测其吸光 抗氧化活性进行测定，在 695 nm 处测定各浓度的吸
度，并通过标准曲线计算总黄酮的含量。经计算， 光度，平行测定 3 次，取平均值。通过标准曲线计
重复性 RSD 为 0.53%<5%。测定结果变异系数较小， 算总抗氧化能力（TA），结果用每克纯化品相当于
说明该方法的稳定性良好，即重复性较好，可反复 多少物质的量芦丁（芦丁当量，Rutin equivalent，
验证。 RE）表示，单位为 μmol RE/g [36] 。
1.6.4 加标回收实验 1.8.3 还原活性测定
由于定量测定的分析方法均需要做准确度验 采用铁氰化钾还原法 [37] 测柠檬桉树脂总黄酮的
证，故为考察该分析方法测定的结果与真实值或参考 还原能力（RA），在 700 nm 下测定吸光度，平行测
值接近的程度，进行加标回收实验并计算回收率 [32] 。 定 3 次，取平均值。最后根据标准曲线计算芦丁当
准确量取粗提液 2 mL，芦丁标准品溶液 2 mL，共 5 量来表示 A 及各纯化品的还原能力。
份，显色后，测定吸光度值，平行测量 3 次，取平
均值。经计算，加标回收率均在 95%~105%内，加 2 结果与讨论
标回收率 RSD=1.67%<5%，测定的结果与真实值接 2.1 柠檬桉树脂中的总黄酮定性分析
近的程度较好，准确度较高。说明该方法准确性好， 2.1.1 柠檬桉树脂中总黄酮的显色反应
可以用于柠檬桉树脂总黄酮含量的测定。 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚羟基
1.7 总黄酮的纯化方法 及 γ-吡喃酮环有关。通过柠檬桉树脂粗提液与特殊
利用柠檬桉树脂中总黄酮与杂质极性的不同， 试剂颜色反应初步判断是否含有黄酮类化合物 [29] 。
选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化的目的 [33] 。 分别取 8 支 10 mL 试管，4 支加入 1 mL 粗提液，另
称取一定质量柠檬桉树脂总黄酮粗提物（A），用蒸 4 支加入芦丁标品溶液，再分别加入盐酸-锌粉、浓
馏水溶解，每次加入 60 mL 氯仿超声萃取 30 min， 硫酸、1%（质量分数）的三氯化铁溶液，振荡，摇
共萃取 3 次，合并 3 次氯仿萃取液，减压浓缩得到 匀，而加入的 1%（质量分数）硝酸铝溶液需在紫外
氯仿萃取物。氯仿萃取物用蒸馏水溶解，再用 40 mL 灯下观察，并与对照品的颜色变化作对比 [27] ，结果
乙酸丁酯超声萃取 30 min，萃取 3 次，合并 3 次乙 如表 1 所示。
酸丁酯萃取液，减压浓缩得到纯化物 B。蒸馏水溶 从表 1 可以看出，盐酸-锌粉反应颜色是鉴定黄
解氯仿萃取物，用二甲基甲酰胺萃取、减压浓缩得 酮类化合物最常用的颜色反应。反应后粗提液呈橙
到纯化物 C。 色，是二氢黄酮的特征反应；浓硫酸反应粗提液颜
按上述实验步骤，A 用 60 mL 二甲基甲酰胺超 色由淡黄色变为红色，证明含有游离的黄酮苷；三
声萃取 30 min，共萃取 3 次，合并 3 次萃取液，减 氯化铁溶液反应粗提液呈绿褐色；向粗提液中加入