Page 91 - 精细化工2019年第8期

第 8 期 陈惠杰，等: 乌腺金丝桃中金丝桃素超声提取工艺及其抗病毒性能 ·1579·

工艺的发展。响应曲面法是目前广泛应用于天然产 柱温 30 ℃，进样量 10 μL。
物中有效化学成分提工艺优化的一种数据处理方 标准曲线绘制：精密称取金丝桃素标准品
法 [13-15] ，具有简便、精度高的优点。目前文献鲜见 1.0 mg，加入甲醇溶解并定容至 5.0 mL，制成质量
采用响应面法优化乌腺金丝桃中金丝桃素超声提取 浓度为 200 mg/L 的金丝桃素标准品溶液，再分别用
工艺的报道。本研究采用响应面法优化乌腺金丝桃 甲醇稀释成 0.625~20.0 mg/L 的系列浓度溶液，依次
中金丝桃素超声提取工艺，同时进行了乌腺金丝桃 注入高效液相色谱仪中，按上述色谱条件测定。以
提取物对 IBV 在鸡胚肾细胞（Chicken embryo kidney 金丝桃素标准品溶液质量浓度 x(mg/L)为横坐标，峰
cells, CEKs）的体外抑制作用研究，以期为金丝桃 面积 y 为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：
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素提取的工业化生产及研发新型抗 IBV 药物提供理 y=68255x8797.3（r =0.9996），说明在 0.625~ 20.0
论依据。 mg/L 呈现良好的线性关系。
金丝桃素提取量按下式计算：
1 实验部分  Vn
金丝桃素提取量/（ mg g/ ）=
m
1.1 材料、试剂与仪器
式中：为提取液中金丝桃素质量浓度，mg/L；V 为
乌腺金丝桃采于吉林省吉林市左家自然保护
提取液体积，mL；n 为稀释倍数；m 为乌腺金丝桃
区，经吉林农业科技学院张忠宝教授鉴定为藤黄科
全草质量，mg。
金丝桃属植物乌腺金丝桃（Hypericumattenuatum）。
1.2.3 乌腺金丝桃提取物的细胞毒性测定
乌腺金丝桃全草鼓风干燥粉碎过 20 目筛，超临界
1.2.3.1 CEK 细胞的制备
CO 2 预处理 2 h 去除杂质，萃余料备用。金丝桃素单
取 17~20 日龄 SPF 鸡胚肾脏，放置于 M199 培
体（MUST-15040218），中国科学院成都生物研究所；
养基中洗涤 2 次，加入质量分数为 0.25%胰酶 5 mL，
M199 培养基，大连宝生物工程有限公司；BI 胎牛
于 37 ℃水浴消化至组织呈疏松透明絮状，离心弃
血清，世国生物科技有限公司；胰酶，分析纯，北
胰酶，加入 2 mL M199 培养基分散，经 200 目铜网
京索莱宝生物科技有限公司；DMSO，分析纯，Sigma
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过滤后，细胞计数调整浓度为 1×10 个/L，分装于
公司；丙酮、无水乙醇、甲醇，分析纯，天津市富
96 孔板中，于 37 ℃体积分数为 5%CO 2 培养箱中
宇精细化工有限公司。由于金丝桃素对光敏感，所
培养。
以文中全部实验是在避光或弱光条件下进行的。
1.2.3.2 乌腺金丝桃提取物的细胞毒性测定
KQ-500GDV 型恒温数控超声波清洗机，昆山
在 96 孔板上培养 CEK 细胞，长满单层后弃去
市超声仪器有限公司；LC-2010 AHT 型高效液相色
细胞生长液，换用无血清 M199 培养基倍比稀释的
谱仪、VP-ODS C18 色谱柱，日本岛津公司；Sartorius
乌腺金丝桃提取物继续培养。提取物质量浓度分别
BT25S 型电子天平，德国 Sartorius 公司；超临界 CO 2
为 5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.1563、0.078、
萃取仪，江苏宏博机械制造有限公司。
0.039、0.0195 g/L，每个浓度均重复 3 孔，同时设
鸡传染性支气管炎病毒 M41 株（IBV-M41）由
正常细胞对照孔，37 ℃体积分数 5%CO 2 培养箱中
东北农业大学动物医学学院病理实验室冻存；SPF
培养，48 h 用改良 MTT 法检测各孔细胞的存活率。
鸡胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
改良 MTT 法 [16] 操作步骤如下：每孔加质量分
1.2 方法
数 0.5% MTT 20 μL，37 ℃继续培养 4 h，每孔加入
1.2.1 乌腺金丝桃提取
100 μL DMSO，振荡混匀 10 min 后，使结晶充分溶
精密称取萃余料 1.78 g（相当于原药材 2.00 g），
解，测定 490 nm 波长处吸光度（OD）。用高于 90%
于 200 mL 锥形瓶中，加入一定量的丙酮-乙醇溶液，
细胞存活率对应的药物浓度作为最大无毒浓度。
超声提取金丝桃素，提取后溶液离心过 0.45 μm 微 乌腺金丝桃提取物 OD
孔有机滤膜，最后用甲醇定容至 100 mL，用 HPLC 细胞存活率/ %= 空白细胞对照组 OD  100
检测其金丝桃素含量。 1.2.4 乌腺金丝桃提取物抗病毒作用的检测
1.2.2 金丝桃素含量的测定 1.2.4.1 药物对病毒的直接灭活作用
色谱条件：Shimadzu Shim-pack VP-ODS C18 将不 同浓度的提 取物与 100TCID 50 （ Tissue
色谱柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）；流动相为甲醇与 Culture Infectious Dose 50）IBV-M41 病毒稀释液
0.006 mol/L 磷酸氢二钠（体积比 90∶10，用磷酸调 等体积混合，IBV-M41 病毒的 TCID 50 为 1×10 5.83 /L。
pH 至 6.5）；检测波长 590 nm；流速 1.0 mL/min； 37 ℃体积分数 5% CO 2 培养箱中作用 2 h，立即接种