Page 100 - 精细化工2019年第9期

·1828· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

效率高、立体专一性强等优点，具有大规模工业生 的亲和力，且不存在副反应，但该酶在催化过程中
产的潜力 [15] 。 需要添加 ATP。Yamamoto 等 [22-24] 利用葡萄糖为底
目前，文献报道的用于合成 L-茶氨酸的酶主要 物偶联酵母发酵作为 ATP 再生系统，为 GMAS 供
有谷氨酰胺酶（glutaminase，EC 3.5.1.2）、γ-谷氨酰 能，转化 24 h L-茶氨酸产量达到 60 mmol/L。利用
转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase，EC 2.3.2.2）、谷 糖酵解的 ATP 再生系统，产生副产物多、产量低、
氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，EC 6.3.1.2） 体系复杂不易控，不利于后续产物分离以及工业化
和 γ- 谷氨酰甲胺合成酶（ γ-glutamylmethylamide 生产。
synthetase，EC 6.3.4.12，GMAS），工艺路线见图 1。 本文建立基于多聚磷酸盐激酶（PPK）的 ATP
其中，谷氨酰胺酶和 γ-谷氨酰转肽酶无需 ATP 供应 再生系统，以多聚磷酸盐（polyP）为底物再生 ATP，
催化生成 L-茶氨酸（图 1a、b）；谷氨酰胺合成酶和 将 GMAS 和 PPK 在大肠杆菌 BL21(DE3)中共表达，
GMAS，需 ATP 供应催化生成 L-茶氨酸（图 1c、d）。 利用廉价的谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物，以 polyP
谷氨酰胺酶和谷氨酰胺合成酶对乙胺的亲和力较低 供能，全细胞生物催化合成 L-茶氨酸，如图 1d 所
[16-19] [20-21]
，γ-谷氨酰转肽酶存在副反应 ，利用这 3 示。该方法极大地降低了生产成本，为工业化生产
种酶合成 L-茶氨酸效率较低。GMAS 对乙胺有很高 L-茶氨酸提供重要参考。

图 1 微生物酶法合成 L-茶氨酸的工艺路线
Fig. 1 Process route of enzymatic synthesis of L-theanine by bacteria

1.2 方法
1 实验部分 1.2.1 目的基因扩增

PCR 反应体系（50 μL）：ddH 2 O（双蒸水）22 μL，
1.1 材料与仪器
上下游引物各 1 μL，模板 1 μL，Taq Mix 25 μL。PCR
1.1.1 原料、试剂及仪器
条件为：94 ℃预变性 3 min；（94 ℃ 1 min，53 ℃
E. coli BL21(DE3)菌株，pETDuet-1 载体为本实
验室保存；Master Mix，南京擎科生物科技有限公 1 min，72 ℃ 2 min），30 个循环；72 ℃延伸 5 min。
司；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶，New England 1.2.2 共表达重组质粒构建
Biolabs；AP-MN-P-250 质粒提取试剂盒、AP-GX-250 将 PCR 扩增的 GMAS 和 pETDuet-1 质粒分别
PCR 产物柱纯化试剂盒、AP-GX-250 胶回收试剂盒， 用限制性内切酶 NcoI 和 EcoRI 双酶切，胶回收双酶
Axygen 公司；其他试剂均为国产分析纯。 切产物，用 T4 DNA 连接酶连接，构建 pETDuet-
MG48+型 PCR 仪，杭州朗基科学仪器有限公 1-GMAS 重组质粒，转化至大肠杆菌 DH5α 中，涂
司；THZ-C 恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂； 板、挑单克隆、测序，得到构建成功的 pETDuet-
Waters e2695 型高效液相色谱仪，美国 Waters 公司。 1-GMAS 重组质粒。将 pETDuet-1-GMAS 重组质粒
1.1.2 菌种及培养基 和 PCR 扩增的 PPK 分别用限制性内切酶 NdeI 和
基因工程菌 pETDuet-1-GMAS-PPK/BL21(DE3) XhoI 双酶切，胶回收双酶切产物，用 T4 DNA 连接
由本实验室构建，其中 GMAS 来源于 Methylovorus 酶连接，构建 pETDuet-1-GMAS-PPK 重组质粒，转
mays No. 9 [23] ，PPK 来源于谷氨酸棒杆菌 [25] ，构建 化至大肠杆菌 DH5α 中，涂板、挑单克隆、测序，
方法参考《分子克隆实验指南》 [26] 。 得到构建成功的 pETDuet-1-GMAS-PPK 重组质粒。