Page 102 - 精细化工2019年第9期

·1830· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 36 卷

程度，以及影响底物和辅酶的解离程度，从而最终 2.2.4 不同二价金属离子对生成 L-茶氨酸的影响
影响酶分子对底物分子的结合与催化。 二价金属离子做辅助因子，具有改变或稳定酶
为考察重组工程菌全细胞催化合成 L-茶氨酸的 的构象、参与酶催化的作用，可影响酶的反应催化
最适 pH，将 1.2.4 中反应体系利用缓冲液（醋酸- 能力。在反应体系中加入不同的二价金属离子，最
醋酸钠缓冲液 pH=56；Tris-HCl 缓冲液 pH=7~11） 终浓度为 100 mmol/L，于 35 ℃、pH=7.0 反应 1 h
配成不同 pH 的反应体系，于 35 ℃反应 6 h 后检测 后取样测定，以不加离子的反应体系做空白对照。
2+
2+
L-茶氨酸生成量。为考察重组菌的 pH 稳定性，将重 如图 6 所示，Mg 、Mn 、Co 2+ 3 种离子对重组菌
2+
组工程菌在不同 pH 的缓冲液中 30 ℃保温 6 h，于 催化合成 L-茶氨酸有一定促进作用，Mg 对重组菌
2+
35 ℃反应 6 h 后进行 HPLC 检测。如图 4 所示，pH=7 催化能力提高最多；Cu 对重组菌合成 L-茶氨酸有
2+
2+
时重组工程菌催化合成 L-茶氨酸能力高且稳定性好。 抑制作用；Ca 、Zn 两种离子无明显影响。

图 4 pH 对重组工程菌 GMAS-PPK 催化合成 L-茶氨酸的
图 6 不同二价金属离子对 L-茶氨酸生成的影响
影响 Fig. 6 Effect of divalent metal ions on the Production of
Fig. 4 Effect of pH on the production of L-theanine catalyzed by L-theanine
GMAS-PPK
2.2.5 Mg 浓度对生成 L-茶氨酸的影响
2+
2.2.3 底物摩尔比对生成 L-茶氨酸的影响
2+
Mg 是 GMAS 催化合成 L-茶氨酸所必需的，
为探究底物摩尔比对生成 L-茶氨酸的影响，考
2+
PPK 同样也需要 Mg 作为辅助因子。本文中探究了
察了谷氨酸钠与乙胺盐酸盐的摩尔比从 1.0∶1.0 到 2+
Mg 浓度对生成 L-茶氨酸的影响，结果见图 7。
1.0∶2.0，反应 24 h 检测生成的 L-茶氨酸含量。如
图 5 所示，较高浓度的乙胺盐酸盐明显抑制了 L-茶
氨酸的生成，谷氨酸钠与乙胺盐酸盐摩尔比 1.0∶1.4 时
最佳。与 γ-谷氨酰转肽酶（GGT）相比，GMAS 催
化乙胺盐酸盐的浓度是 GGT 浓度的十分之一 [15] ，因
此，利用 GMAS 制备 L-茶氨酸可大大降低生产成本。

2+
图 7 Mg 对 L-茶氨酸生成的影响
2+
Fig. 7 Effect of Mg on the production of L-theanine

2+
结果显示，当 Mg 浓度从 50 mmol/L 增加到
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150 mmol/L 时，L-茶氨酸产量随着 Mg 浓度增加而
2+
增加，但是高浓度的 Mg 没有使 L-茶氨酸的产量进

2+
图 5 谷氨酸钠与乙胺盐酸盐底物摩尔比对 L-茶氨酸生 一步增加。文献报道低浓度的 Mg 可以与 polyP 形
成的影响 成络合物，影响 GMAS 蛋白构象改变，从而影响其
Fig. 5 Effect of the mole ratio of monosodium glutamate 酶学性质 [23] 。但是高浓度的 Mg 会对重组菌催化
2+
to ethylamine hydrochloride on the production of
2+
L-theanine 能力产生抑制作用，所以 Mg 浓度以 150 mmol/L