Page 101 - 精细化工2019年第9期
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第 9 期                   潘鑫茹，等:  共表达 PPK 和 GMAS 全细胞催化合成 L-茶氨酸                            ·1829·


            1.2.3    重组蛋白的表达及酶活检测
                 将重组质粒 pETDuet-1-GMAS-PPK 热激法转化
            至 E. coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含氨苄抗
            性的 LB 平板上，37 ℃培养 12 h，得到基因工程菌
            pETDuet-1-GMAS-PPK/BL21(DE3)单菌落。挑单菌
            落于含 100  mg/L 氨苄青霉素的 LB 平板上划线，
            37 ℃培养 12 h；用接种环挑取一环接种于 3  mL 含

            100 mg/L 氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 ℃、200 r/min             M: Marker；1~3: pETDuet-1-GMAS-PPK 全蛋白、上清蛋白、沉
            培养 12 h；将上述培养物按体积分数 1%接种量接入                        淀蛋白；4~6:  pETDuet-1-PPK 全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白；
                                                               7~9: pETDuet-1-GMAS 全蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白
            含 100  mg/L 氨苄青霉素的 50  mL  LB 培养基中，
                                                                    图 2    SDS-PAGE 分析共表达 GMAS 和 PPK
            37 ℃、200  r/min 培养至 OD 600 为 0.5，加入终浓度             Fig. 2    SDS-PAGE analysis of co-expression GMAS and PPK
            为 0.3 mmol/L 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），
                                                               2.2   反应条件优化
            28 ℃诱导 7 h。6000 r/min,4 ℃离心 15 min 收集菌体
                                                               2.2.1    温度对重组工程菌催化合成 L-茶氨酸的影响
            细胞。GMAS 和 PPK 的酶活测定方法参照文献
                                                                   温度通过改变酶蛋白的空间构象，影响生物催
            [22,27]。
                                                               化剂酶的活性，最终影响产物的产率。在一定范围
            1.2.4    全细胞催化合成 L-茶氨酸
                                                               内，温度降低时酶促反应速度降低，温度升高时酶促
                 L-茶氨酸标准反应体系：含 200 mmol/L 谷氨酸
                                                               反应速度加快；而温度过高时又会导致酶蛋白变性
            钠，200 mmol/L 乙胺盐酸盐，75 mmol/L 六偏磷酸
                                                               失活。因此，酶促反应最适温度是综合平衡的结果。
            钠，150  mmol/L  MgSO 4 ·7H 2 O，4  mmol/L  ATP。
                                                                   将 pETDuet-1-GMAS-PPK 重组工程菌置于不同
            用 Tris-HCl 缓冲液（pH=8.0，200  mmol/L）调反
                                                               温度的 L-茶氨酸标准反应液中，温度梯度设置为
            应液 pH=7.0，加入 20  g/L 浓度的菌体，35 ℃、
                                                               30、35、40、45、50、55、60 ℃，反应 6  h 取样进
            200  r/min 振荡反应，利用 HPLC 检测反应产物 L-
                                                               行 HPLC 检测。如图 3 所示，随着温度的升高，重
            茶氨酸。
                                                               组工程菌催化合成 L-茶氨酸能力升高，当温度升高
                 HPLC 检测 L-茶氨酸条件：色谱柱为  Poroshell
                                                               至 45 ℃以上，重组工程菌催化合成 L-茶氨酸能力
            120 SB-C18 (4.6 mm×100 mm×2.7 μm)  ，柱温 30 ℃，
                                                               开始下降。
            以体积分数 95%的 20  mmol/L  NH 4 H 2 PO 4 ·H 3 PO 4
            （pH=2.9）和体积分数 5%的乙腈为流动相，流速
            0.4  mL/min，等梯度洗脱，紫外检测器，检测波长
            为 210 nm，进样量 2 μL。

            2   结果与讨论

            2.1    重组工程菌表达蛋白 SDS-PAGE 分析
                 将 pETDuet-1-GMAS-PPK/BL21(DE3)、pETDuet-
            1-PPK/BL21(DE3)和 pETDuet-1-GMAS/BL21(DE3)

            这 3 种基因工程菌分别接种到装有 20 mL LB 的 100 mL
                                                               图 3    温度对重组工程菌 GMAS-PPK 催化合成 L-茶氨酸
            三角瓶中（含有 100 mg/L 的氨苄青霉素），37 ℃、
                                                                    的影响
            200  r/min 培养 12  h。按体积分数 1%接种量接入装                 Fig. 3    Effect of temperature on the production of L-theanine
            有 100 mL LB 的 500 mL 三角瓶中，加入 IPTG 诱导                     catalyzed by GMAS-PPK

            过夜，将发酵菌泥进行超声处理，获得全蛋白、上                                 为考察重组工程菌的热稳定性，将菌体细胞预
            清蛋白、沉淀蛋白，SDS-PAGE 电泳检测蛋白表达，                        先放置在上述不同温度中处理 1 h，再加入反应体系
            如图 2 所示。                                           中，6 h 后取样进行 HPLC 检测。如图 3 所示，重组
                 结果表明，GMAS 和 PPK 基因分别在 49 和 38                 菌在 30~35 ℃之间催化合成 L-茶氨酸能力高，35 ℃
            KD 处有特异性蛋白表达；pETDuet-1-GMAS-PPK                    时，重组工程菌合成 L-茶氨酸能力最强。
            成功共表达 GMAS 和 PPK 两种蛋白，且大部分是                        2.2.2    pH 对重组工程菌催化合成 L-茶氨酸的影响
            可溶性蛋白。                                                 pH 的改变可以影响酶活性中心上基团的解离
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