Page 97 - 精细化工2019年第9期

第 9 期 张凯强，等: 有机介质中包衣菌体催化合成 c9,t11-共轭亚油酸 ·1825·

1.0%的丙酮溶液，滴加到用 pH 5.8 PBS 重悬的菌液 包衣菌体在水溶液中重复使用 3 次后的催化活性即
中，4 ℃处理 4 h 后冷冻干燥即成。此时，c9,t11-CLA 出现显著下降，c9,t11-CLA 的产量仅为 703 mg/L。
的产量为 932 mg/L。 结果表明，菌体包衣处理后，酶的活性更加稳定，
实现了多次重复使用，能显著降低生产成本。有研
究表明，采用室温是固态的离子液体对转氨酶进行
包衣后，能持续反应 27 d，该发现为寻求新型包衣
材料提供了新的研究方向 [22] 。

图 7 干燥方式对包衣菌体酶活的影响
Fig. 7 Effect of dry methods on the activity of enzyme in
coated bacteria

2.3 包衣菌体的催化特性考察

将在优化条件下制得的包衣菌体加入到 2 g/L
亚油酸的正己烷中，反应一定时间，c9,t11-CLA 的 图 9 菌体重复使用的稳定性
Fig. 9 Stability of reusing of bacteria
产量如图 8 所示。由图 8 可见，反应初期的产物合
成速度较快，当反应从 6 h 延长至 18 h 时，c9,t11- 2.4 包衣菌体的催化反应动力学
CLA 的产量从 941 mg/L 上升至 1906 mg/L，18 h 后 米氏方程是研究酶反应的基本动力学方程，可
反应趋于稳定，继续延长反应时间已不能显著增加 以确定酶反应速度和底物浓度之间的关系，也被用
c9,t11-CLA 的产量，底物的转化率高达 95.3%。而 于细胞中酶的催化反应研究 [23] 。在酶动力学中，米
将未经包衣处理的菌体加入到含亚油酸的正己烷 氏常数 K m 是酶的一个基本特征常数，其物理意义是
中，未能检测到 c9,t11-CLA 的生成。表明未经包衣 指酶的活性中心一半被底物结合所需底物的浓度，
处理菌体中的亚油酸异构酶在有机溶剂中迅速失去 K m 越小，表明酶和底物的亲和力越强。测定 K m 最
催化活性，通过表面活性剂对菌体进行包衣处理， 常用的方法是双倒数作图法。
能有效防止有机溶剂对酶活性中心结构的影响。 通过测定包衣菌体中亚油酸异构酶在一系列亚

油酸浓度下的反应速度（V），采用双倒数作图法，
以 1/c 为横坐标，1/V 为纵坐标作图，结果见图 10。
纵坐标截距为 1/V max ，横坐标截距为-1/K m ，由此可
以求得亚油酸为底物时包衣菌体中亚油酸异构酶的
K m 为 35.7 mmol/L，V max 为 5.6 mmol/h。在水溶液中，
未包衣菌体中亚油酸异构酶的 K m 为 22.1 mmol/L，

图 8 反应时间对 c9,t11-CLA 产量的影响
Fig. 8 Effect of reaction time on the synthesis of c9,t11-
CLA

通过对包衣菌体在有机溶剂和未包衣菌体在水
溶液中分别进行多批次重复转化实验，测得 c9,t11-

CLA 的产量见图 9。由图 9 可见，包衣菌体在有机
图 10 亚油酸浓度和包衣菌体中酶活的双倒数拟合线
溶剂中重复使用 5 次仍然具有较高的催化活性， Fig. 10 Double reciprocal plot of the relationship of LA
c9,t11-CLA 的产物质量浓度达到 1527 mg/L，而未 concentration to LA isomerase activity