Page 94 - 精细化工2019年第9期
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·1822·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                  第 36 卷

                       [2]
            约为 10  mg 。研究发现，CLA 具有多种生理活性                       种接种于 MRS（de Man, Rogosa and Sharpe）培养基
                                                        [5]
                        [3]
                                          [4]
            功能，如抗癌 、抗动脉粥样硬化 、预防糖尿病 、                           中，菌体经活化后按体积分数 5%的接种量接种到
                [6]
                                                 [7]
            减肥 等。毒理学研究表明其对人体无毒 。因此，                            MRS 培养基中，30 ℃培养 24 h，6000 r/min 离心 10
            如何实现大量制备 CLA 异构体单体成为当前研究                           min，除去上清液，用无菌水洗涤菌体，离心收集菌
            的热点和难点。                                            体，4 ℃冷藏备用。
                 通过化学合成法可以大量制备 CLA，但所得                         1.2.2    谷氨酸二烷基酯核糖醇的合成
                                   [8]
            CLA 异构体的组成复杂 。为了获得纯度较高的                                按宋宝东等的方法进行           [16] 。分别以正辛醇、月
            CLA 单体，人们建立了生物合成 CLA 单体的方法，                        桂醇和肉豆蔻醇 3 种脂肪醇为原料进行合成反应，
            如通过 Lactobacillus casei（干 酪乳 杆菌 ）合 成               产物在丙酮中重结晶两次，得到 3 种白色粉末状的
                      [9]
            c9,t11-CLA ，通过 Propionibacterium acnes（疮疱          谷氨酸双八烷基酯核糖醇、谷氨酸双十二烷基酯核
            丙酸杆菌）合成 t10,c12-CLA        [10] 。由于反应底物亚           糖醇和谷氨酸双十四烷基酯核糖醇。
            油酸和产物 CLA 均是疏水性物质，基于水溶液的传                          1.2.3    包衣菌体的制备
            统发酵实质是在非均相进行的酶催化反应，受相际                                 将 10 g 湿菌体用 50 mL 50 mmol/L 磷酸盐缓冲
            接触面积的限制，在水溶液中生物合成 CLA 的水平                          液（pH 5.8）洗涤，6000 r/min 离心 10 min，收集菌
            通常低于 500 mg/L    [11] 。此外，为从发酵液中提取出                体，将 湿菌 体重悬于 200  mL 磷 酸盐缓 冲液
            产物，需用有机溶剂多次萃取，生产工序多、工艺                             （60 mmol/L，pH 5.8）中，向其中缓慢滴加 40 mL
            复杂，生产成本较高。包衣酶是在 1980 年由日本学                         质量分数为 1%的谷氨酸二烷基酯核糖醇的丙酮溶
            者 Goto 首次提出，在表面活性剂的保护下，酶在有                         液，混合均匀，于 4 ℃搅拌处理 6 h，6000 r/min 离
            机介质中不易变性和失活            [12-13] ，仍具有很高的催化           心 10 min，收集菌体，菌体经80 ℃预冻后进行-35
            活性，从而实现酶在有机介质中完成各种催化反应，                            ℃冷冻干燥，得到包衣菌体。
            可以显著提高疏水性底物和产物的转化和合成效率                             1.2.4    包衣条件对菌体催化活性的影响
            [14-15] 。目前，未见有通过包衣菌体合成 CLA 的报道。                       在不同设定条件下对菌体进行包衣处理，将
            本文通过高效液相色谱分析，确定了包衣菌体能高                             10 mg 包衣菌体加入到 5 mL 正己烷中，搅拌均匀，
            效合成 CLA 异构体单体。                                     加入 10  mg 亚油酸，在 25 ℃下振荡反应 6  h。
                 本文通过合成 3 种谷氨酸二烷基酯核糖醇非离                        6000 r/min 离心 10  min，分离包衣菌体，取正己烷
            子型表面活性剂，直接对 Lactobacillus helveticus L7            溶液进行 HPLC 分析，测定其中 c9,t11-CLA 的含量，
            菌体进行包衣处理，考察了包衣条件对菌体中亚油                             据此对包衣条件的表面活性剂种类、添加量和溶剂
            酸异构酶活性的影响，以及包衣菌体在有机介质中                             种类、缓冲液 pH、包衣时间和温度、干燥方式进行
            的催化特性，为在有机介质中生物合成 c9,t11- CLA                      单因素优化。
            单体奠定了理论基础。                                         1.2.5    包衣菌体的催化特性考察
                                                                   取 10  mg 包衣菌体加入到 5  mL 正己烷中，并
            1    实验部分                                          加入 10 mg 亚油酸混匀，在 25 ℃下振荡反应一定时
                                                               间，测定其中 c9,t11-CLA 的产物浓度和转化率，研
            1.1    材料、试剂与仪器
                                                               究反应时间对产物收率的影响。同时进行 8 批次重
                 Lactobacillus helveticus L7 为本实验室分离鉴
                                                               复转化实验，研究包衣菌体重复使用的稳定性。
            定并保存。乳酸菌培养基，BR，生工生物工程（上                            1.2.6    包衣菌体催化反应动力学
            海）股份有限公司。谷氨酸、正辛醇、月桂醇、肉                                 通过测定包衣菌体在一系列亚油酸浓度下的
            豆蔻醇、对甲基苯磺酸、甲苯、氯仿、正己烷、丙                             c9,t11-CLA 合成速度，采用双倒数作图法，求得包
            酮、盐酸、葡萄糖酸内酯、三乙胺、乙醇、亚油酸、                            衣菌体中亚油酸异构酶的米氏常数和最大反应速
            丙酮、乙醇、Na 2 HPO 4 、NaH 2 PO 4 、Na 2 CO 3 ，AR，       度，计算公式如下所示：
            生工生物工程（上海）股份有限公司。                                                V=c V max /（K m +c）
                 3K18 高速冷冻离心机，德国 Sigma 公司；                     式中 ： V— 反 应速度（ mmol/h ）， c— 底物浓 度
            FM12-EL 冷冻干燥机，美国 Virtis 公司；1100 高效                 (mmol/L)，V max —最大反应速度（mmol/h），K m —米
            液相色谱仪，美国 Agilent 公司。                               氏常数  (mmol/L)。
            1.2   方法                                           1.2.7    c9,t11-CLA 产量分析
            1.2.1    Lactobacillus helveticus L7 菌株的培养             c9,t11-CLA 含量的测定按金磊等的方法进行             [17] ，
                 将实验室冻存的 Lactobacillus helveticus L7 菌         采用高效液相色谱法，色谱柱为 Chrom  Spher  5
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