Page 39 - 《精细化工》2020年第7期
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第 7 期 池伟亚，等: 逆体积排阻色谱法在评价色谱介质孔径结构方面的应用 ·1321·
质可分为硅胶类、多糖类、合成高聚物类和无机类， 因此，降低介质的孔径尺寸有利于提高介质的比表
不同基质的介质之间孔隙结构存在明显差异。 面积，但如果介质的孔径尺寸太小则会影响孔隙中
目前，大多数的商品介质中，商家并没有给出 蛋白质的传质，反而使蛋白载量下降。因此，在分
全面的孔径结构信息，因此表征层析介质的孔结构 离纯化时，需要选择适当比表面积的层析介质使分
就显得尤为重要。人们最常用的测定层析介质孔径 离效果达到最佳。
结构的方法有氮气吸附法、压汞法和逆体积排阻色 根据基质的不同，层析介质可以分成琼脂糖、
谱法（ISEC）等。ISEC 作为一种很重要的测定孔径 葡聚糖、纤维素、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、
结构的方法，被广泛应用于多种层析介质固定相的 二氧化硅和玻璃纤维等多种材质。基质不同导致孔
孔径信息测定，其中包括二氧化硅 [3-4] 、核-壳介质 [5-6] 、 结构存在差异，例如：琼脂糖基质的孔结构是五角
[7]
聚合物介质 、有机-无机杂化整体柱 [8-9] 和毛细管通 形的孔组成的网状结构，不耐压；纤维素的孔结构
道聚合物纤维固定相 [10] 等。除了表征层析介质孔的 不均一；二氧化硅和聚甲基丙烯酸甲酯的孔径较大。
结构外，ISEC 还被广泛应用在其他多孔材料孔结构 基质孔结构的差异间接或直接影响着分离纯化过程
的表征中，如纤维素 [11-12] 、活性炭 [13] 等。 中的传质行为，最终影响分离纯化的效果。
ISEC 与氮气吸附法及压汞法相比最大的优势
2 ISEC 及其他孔径结构测定方法
是：它的测定条件与层析介质的实际使用条件接近，
所测得的结果误差小 [10] 。测定层析介质的孔径结构， 2.1 ISEC
明确层析介质的孔径结构与其分离纯化效果之间的 图 1 是 ISEC 和 SEC 的示意图。如图 1 所示，
关系，能够为蛋白质、多肽等生物大分子分离纯化 ISEC 法是 SEC 的反向应用，SEC 法是通过已知孔
过程中层析介质的选择提供一定的理论指导，对提 径分布的多孔介质来测定探针分子的大小，而 ISEC
高层析效率有一定的理论和现实意义。 法是通过一系列已知相对分子质量的探针分子来得
到色谱介质的孔径分布，两者在工作原理上一致 [21] 。
1 层析介质的孔径结构
在使用 ISEC 测试介质孔径结构时，流动相在色谱
柱的可流通空间由两部分组成，一部分是介于色谱
层析介质孔径结构与其层析性能之间关系密
介质颗粒间的空隙，另一部分是色谱介质颗粒内的
切，研究两者之间的关系规律能够为层析过程的优
孔隙。当探针分子随流动相进入到色谱柱后，不同
化提供理论指导。目前，文献报道的介质孔径结构
相对分子质量大小的探针分子流经色谱柱所经过的
参数有平均孔径、孔径分布、孔隙连通性、孔隙率
路径长度不同，停留时间不同，相对分子质量较大
和比表面积等。
平均孔径 [4,14-15] 是表征层析介质孔结构的最基 的探针分子只能进入色谱介质中较大的孔隙和介质
颗粒间的空隙，所以流经路径较短，会首先流出色
本参数，可以决定层析介质所能分离纯化的蛋白质
谱柱；而相对分子质量较小的探针分子能够在进入
尺寸大小。了解层析介质的平均孔径，有利于针对
较大孔隙和空隙的同时进入到更小的孔隙中，因此
一定尺寸的蛋白质分子高效的选择特定孔径的层析
介质进行分离纯化。孔径分布 [10,16-18] 关系到色谱介 流经路径较长，会较晚流出色谱柱。
质所能分离的蛋白质尺寸的范围。得到介质孔隙的
最小和最大尺寸，就能够得到可通过介质孔隙的最
小和最大的蛋白分子的尺寸，也就能够确定该介质
适合分离蛋白质的尺寸范围，能够简化蛋白质分离
中的介质选择过程。层析介质的孔隙连通性 [19] 会影
响溶质分子在介质孔隙中的传质行为，孔隙连通性
越好，越有利于溶质分子的传质，则有利于分离纯
化过程的进行。HO 等 [19] 曾研究表明，孔隙连通性
在很大程度上影响着溶液的传质，膜通量与孔隙连
通性相关，不同类型的膜，形成过程和底层形态不 图 1 ISEC 和 SEC 的示意图
Fig. 1 Schematic of ISEC and SEC
同，孔的连通性也不相同。比表面积与介质的蛋白
载量相关 [2,20] ，一般情况下，介质的比表面积增加会 ISEC 测定介质孔径分布时需要选定一系列的
导致蛋白载量增加。对于孔径较大的介质，比表面 标准物质，其选择标准是：（1）相对分子质量最大
积较小；而对于孔径较小的介质，比表面积较大。 的探针需要只能进入介质颗粒间的空隙中，而不能
