Page 163 - 《精细化工》2021年第4期

第 4 期 王语聪，等: 汉麻叶中大麻二酚的分离纯化及其抗抑郁功能 ·797·

表 1 CBD 初步纯化的洗脱程序 并暴露于 CUMS 程序；空白组仅灌胃等体积的橄榄
Table 1 Elution procedures for preliminary purification of CBD 油。其中氟西汀剂量是根据孙晓花等 [22] 探究白藜芦
流动相 A 流动相 B 洗脱速度/ 醇对抑郁模型小鼠mir-155相关炎症因子影响的剂量，
步骤 时间/min
体积分数/% 体积分数/% （mL/min） [23]
选取 2 mg/kg；CBD 剂量是根据 SHOVAL 等 探究
1 0~40 100 0 20
CBD 对抑郁模型小鼠的享乐效用中效果较好的剂
2 40~100 80 20 20
量，选取 15 及 30 mg/kg。
3 100~160 60 40 20
在两周适应性喂养后，进行 CUMS 程序。除空
4 160~240 40 60 20
白组外，建立慢性不可预测轻度压力的小鼠模型 [24] 。
5 240~360 20 80 20
每周给予小鼠 7 种（S1~S7）不同刺激。S1：1 min
6 360~420 0 100 20
悬尾（距尾尖 1 cm）；S2：光照（24 h）；S3：倾斜
1.2.3 CBD 的精制纯化 笼子（30°）；S4：禁食（24 h）；S5：禁水（24 h）；
柱料 B 使用无水乙醇浸泡 2 h 后，用纯水冲洗 S6：湿垫料（200 mL 纯净水，100 g 垫料）；S7：冷
至无醇味，采用湿法将柱料 B 灌入 BXK 16/100 柱 水游泳（4 ℃，5 min）。每周随机且不重复选择刺激
（内径 16 mm×长度 100 cm），以 2 BV/h（3 mL/min） 方式的顺序。
的流速用纯水洗涤 3 BV。取 1.2.2 处理后含有目标 各分组小鼠于每日刺激前 30 min 进行灌胃，直
物的洗脱液 60 mL 上样，以约 0.5 BV/h 速度上样 到 8 周后 CUMS 处理程序结束时为止，实验期间小
（1 mL/min）。流动相 A为水、B为乙醇，流速 2 BV/h 鼠自由采食和饮水。在最后两周进行蔗糖偏好测试、
（3 mL/min），检测波长 220 nm，洗脱程序参照表 2。 强迫游泳及悬尾测试。测试在给药后 1 h 进行，以
当 UV（220 nm）数值大于 20 mAU 收集洗脱峰并检 确定压力模型成功建立。在行为测试后牺牲小鼠，麻
测其 CBD 含量，针对较大洗脱峰采用前部、中部和 醉后，取眼球血和脑部组织，分离纹状体、脑海马、
后部的方式收集。 前额皮质组织等，保存于–80 ℃冰箱中，以便后续
指标检测。
表 2 CBD 精制纯化的洗脱程序
Table 2 Elution procedures for refined purification of CBD 1.2.6 蔗糖偏好测试
蔗糖偏好测试反映小鼠的愉悦感。在建模后对
流动相 A 流动相 B 洗脱速度/
步骤 时间/min 小鼠进行为期 3 d 蔗糖偏好适应性训练，其中第 1 d
体积分数/% 体积分数/% （mL/min）
1 0~60 100 0 3 为两瓶纯净水，第 2 d 将两瓶水更换为质量分数为
2 60~120 80 50 3 1%的蔗糖水，第 3 d 进行为期 24 h 禁食，第 4 d 进
3 120~180 60 80 3 行蔗糖偏好实验，放置两瓶分别为等体积的质量分
4 180~240 0 100 3 数为 1%蔗糖水溶液和纯净水，经过 24 h 后记录两
瓶溶液的消耗量，并按下式计算蔗糖偏爱程度：
1.2.4 CBD 纯度检测方法 蔗糖偏爱程度/%=糖水消耗量/（糖水消耗量+
参考夏林波等 [21] 的检测方法：C18（柱长 150 mm， 纯净水消耗量）×100
直径 4.6 mm，粒径 5 μm）色谱柱，流动相为乙腈- 1.2.7 强迫游泳测试
水（体积比 68∶32），流速为 0.8 mL/min，检测波 强迫游泳是根据小鼠的静止时间来反映小鼠的
长为 220 nm，柱温 30 ℃。 绝望程度 [25] 。强迫小鼠游泳实验总时长为 6 min，
1.2.5 实验动物分组及干预 前 2 min 为适应时间，记录后 4 min 内小鼠保持不动
取 3 周龄 C57BL/6 雄性小鼠饲养于（22±2） ℃、 时间。实验结束后将小鼠吹干后放回笼中。
湿度 50%±10%条件下，全部喂食标准饮食（AIN-93M）， 1.2.8 悬尾测试
12 h 光/暗周期进行 2 周的适应性喂养。所有实验步 悬尾测试反映小鼠的焦虑程度 [26] 。在用固定贴
骤遵循实验动物护理和使用指南：第八版，ISBN-10： 纸将小鼠尾尖部 2 cm 处固定于悬尾箱顶部，将小鼠
0-309-15396-4，由西安交通大学动物伦理委员会批 身体调整至倒立状态，使其头部距离箱底部 50 cm
准。小鼠随机分成 5 组，每组 10 只。阳性对照组为 左右，总时长为 6 min，前 3 min 为适应时间，记录
氟西汀溶解于去离子水中，剂量为 2 mg/kg；CBD 后 3 min 内小鼠保持不动时间。为避免外环境所带
低剂量组（剂量为 15 mg/kg）、CBD 高剂量组（剂 来的实验误差，整个记录过程需要小鼠一直处于观
量为 30 mg/kg）均将 CBD 溶解于橄榄油中；以 察不到操作人员的状态。
10 mL/(kg·d)剂量进行灌胃，并同时暴露于 CUMS 1.2.9 脑部皮层和海马组织中 mRNA 提取和检测
程序。模型组按照上述剂量灌胃等体积的橄榄油， 用 Trizol 抽提法 [27] 提取脑组织中总 RNA 并用