Page 164 - 《精细化工》2021年第4期

·798· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 38 卷

逆转录酶 PrimeScriptTM RT 合成 cDNA，然后进行 2）、40%乙醇（峰 3）、60%乙醇前部（峰 4-A）、60%
PCR 扩增。通过 SYBR green PCR 试剂盒测量 mRNA 乙醇后部（峰 4-C）、80%乙醇（峰 5）条件处理所
表达，并使用 CFX96TM 系统进行实时检测。两步 得的洗脱峰均不含有 CBD，100%乙醇处理也并未获
PCR 扩增的标准程序：95 ℃ 30 s，循环 1 次；95 ℃ 得洗脱峰，CBD 主要存在于 60%乙醇处理的洗脱峰
s
3 s；60 ℃ 30 循环 40 次；进入溶解曲线阶段。小 4-B 中，将峰 4-B 洗脱液进行旋转蒸发浓缩后待下
鼠源前后端引物序列如表 3 所示。用 GAPDH 的 一步精制纯化。
mRNA 作为内参，2 –Ct 方法分析基因 TNF-α、IL-1β 2.2 CBD 精制纯化
和 iNos 在 mRNA 水平的相对表达量。 CBD 精制纯化后的液相色谱如图 2 所示。将含
有 CBD 醇溶液（峰 4-B）浓缩后上样，采用不同体
表 3 RT-PCR 引物序列 积分数的乙醇（0、50%、80%、100%）进行洗脱，
Table 3 Primer sequences used for semi-quantitative RT-PCR
analysis 由 CBD 纯度测定结果可知，其中水（峰 1-A、1-B、
1-C）、50%乙醇（峰 2） 、100%乙醇（峰 4）条件处
上游引物 下游引物
IL-1β TGACGGACCCCAAA TCTCCACAGCCACAAT 理所得的洗脱峰均不含 CBD，CBD 主要存在于 80%
AGATGA GAGT 乙醇处理的洗脱峰 3 中。从洗脱行为上可以认为，
TNF-α CCCTCACACTCAGA CTACGACGTGGGCTA 柱料 B 性能类似 C18，需要较大体积分数的乙醇进
TCATCTTCT CAG
iNos GGAGCGAGTTGTGG CCAGGAAGTAGGTGA 行目标物质 CBD 的洗脱。为了减少杂质，可先用体
ATTG GGG 积分数 50%乙醇洗脱极性较大的杂质，再用体积分
GAPDH TGGAGAAACCTGCC TGGAAGAATGGGAGT 数 80%乙醇进行洗脱，收集洗脱峰，真空条件下旋
AAGTATGA TGCTGT
转蒸发至液体浑浊，冷藏 48 h，使用 0.45 m 有机
1.3 数据处理 滤膜过滤，收集膜上的结晶进行后续研究。
用 Origin2017、IBM SPSS Statistics 20 软件分
析相关数据。实验数据表示为平均值±标准误差
（Mean±SEM），并且每个实验独立重复至少 3 次，
P<0.05 为显著，P<0.01 为极显著。

2 结果与讨论

2.1 CBD 初步纯化
CBD 初步纯化后的液相色谱如图 1 所示。

图 2 CBD 精制纯化后的液相色谱图
Fig. 2 Liquid chromatography of CBD after refine and
purification

2.3 CBD 纯度检测结果
将 1.2.1 节得到的 CBD 上样原液、经精纯后
CBD 样品以及 CBD 标准品进行纯度检测，首先将
送检样品瓶中加入 1 mL 样品，振荡后取 100 μL，
用流动相乙腈-水（体积比 68∶32）稀释 10 倍，过
0.22 μm 滤膜上机，结果如图 3 所示。其中，CBD

图 1 CBD 初步纯化后的液相色谱图 标准品、经纯化后的 CBD 样品出峰时间均为 10.17 min。
Fig. 1 Liquid chromatography of CBD after preliminary 采用峰面积归一法计算其纯度，上样原液中 CBD 含
purification
量为 12.9 mg/g（纯度为 1.29%），经纯化后得到样
图中主要有 5 个洗脱峰，将所有收集的洗脱液 品 CBD 纯度约为 99.19%（以 220 nm 检测，目标物
保存至–4 ℃下，按照 1.2.4 节条件测定 CBD 纯度。 峰面积占总峰面积的百分比计）。除此之外，样品中
通过对比各洗脱液与 CBD 标准品的出峰时间，确定 含微量（纯度 0.45%）极性较强的未知物质和微量
洗脱液中是否含有 CBD。由 CBD 纯度测定结果可 （纯度 0.36%）非极性的未知物质，说明通过此法
知，水（峰 1）、20%（体积分数，下同）乙醇（峰 得到 CBD 样品纯度为 99.19%。