Page 80 - 《精细化工》2021年第6期
P. 80

·1142·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 38 卷

                 目前，为获得具有良好吸附性能的酶标板，主要                         1    实验部分
            通过改善注塑条件或对其进行后处理改变其表面特
            征。PS 微孔板表面改性的方法主要有等离子体                     [6-7] 、  1.1   试剂与仪器
                  [8]
            γ 射线 、紫外（UV）辐射         [9-10] 和湿化学 [11] 等。其中，          PS 微孔板（96 孔，医用级）、二甲基亚砜
            低温等离子体表面改性技术能够直接在材料表面引                             （DMSO）、吐温-20，AR，天津市江天化工技术有
            入官能团，改善其润湿性、生物相容性及电学性能                             限公司；丙烯酰胺，AR，天津博迪化工股份有限公
            等，且具有不引入其他杂质、易操作、处理时间短                             司；SMCC，BR，大连美仑生物技术有限公司；三
            等优点    [12-16] 。郑力行 [17] 利用低温等离子技术将顺丁              乙胺（TEA），AR，天津市景泓鑫化工有限公司；
            烯二酸酐、丙烯酸及氨基磺酸分别接枝于 PS 微孔板                          BSA（色谱纯度≥98%），BR，国药集团化学试剂有
            表面，结果发现 PS 表面亲水性显著提高，水接触角                          限公司；辣根过氧化物酶标记 BSA（BSA-HRP，质
            最低达到 16.9，比未处理时减小了 80.5%，但其并                      量浓度为 1 g/L），BR，上海远慕生物科技有限公司；
            未对改性后的酶标板进行蛋白吸附研究。冯波等                       [18]   四甲基联苯胺（TMB），BR，上海碧云天生物技术
                           60
            利用 UV 辐照与 Co γ 射线辐照处理 PS 微孔板，对                     有限公司。
            人类免疫缺陷病毒(HIV)抗原进行了吸附检测，发现                              TS-PL10 型等离子清洗机，深圳市东信高科自
                                       60
                               5
            PS 微孔板经过 810  rad 的  Co  γ 射线辐照后，                 动化设备有限公司；JY-150 型接触角测定仪，承德
            ELISA 的检测灵敏度提高了约 2 倍，比 UV 辐照效                      试验机有限责任公司；6700 型傅里叶变换红外光谱
            果更佳。秦金桥        [19] 采用低温等离子体技术对丝素纤                 仪、K-Alpha 型 X 射线光电子能谱仪、Multiskan Mk3
                                                               型酶标仪，美国 Thermo Fisher Scientific 公司；
            维人工血管材料进行表面处理，使用化学偶联剂
            1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基羰二亚胺（EDC•HCl）                    Dimension3100 型能谱仪，美国 Veeco 公司；UV-2450
                                                               型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司。
            和 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）将再生丝素蛋白接枝
                                                               1.2   方法
            到其表面，提高材料的生物相容性。经蛋白修饰后
                                                               1.2.1   等离子体处理制备 PS-g-NH 2
            材料表面的牛血清蛋白（BSA）吸附量为 19.6 mg/g，
                                                                   将 PS 微孔板依次用去离子水和无水乙醇在超
            比未处理时增加了 24.1%。由此可见，等离子体处
                                                               声波清洗机中分别清洗 10 min，除去表面的污染物，
            理在生物医用领域有较为广阔的应用前景。但对于
                                                               置于真空干燥箱中 60 ℃下干燥 2 h，备用。将干燥
            用等离子体改性 PS 微孔板进而提高 ELISA 检测灵
                                                               后的 PS 微孔板置于 96 针放入等离子清洗机，通入
            敏度的研究较少。因此，筛选易与 PS 表面结合并更
                                                               30 mL 丙烯酰胺（低压下升华成气体），分别改变功
            高效偶联蛋白的化合物，进而采用等离子体表面改
            性技术制备功能化的 PS 微孔板具有重要意义。                            率（200、300、400、500、600 W，处理时间为 300 s）、
                                                               处理时间(60、120、180、300、600 s，处理功率固
                 马来酰亚胺基类活泼酯是应用较普遍的一种异
                                                               定为 300 W)对 PS 微孔板进行等离子体处理，得到
            性双功能偶联剂。其中，4-(N-马来酰亚胺基甲基)
            环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯（SMCC）最为稳定                   [20] 。  PS-g-NH 2 。
                                                               1.2.2  PS-g-SMCC 的制备
            SMCC 一端的 NHS 酯可以与氨基反应形成稳定的酰                            称取一定质量的 SMCC 溶于 DMSO 中，滴加三
            胺键，另一端的马来酰亚胺基团可以与蛋白质分子
                                                               乙胺调节溶液 pH 到 7.2~7.5。将等离子处理后的 PS
            的巯基发生特异性交联。本文拟采用低温等离子体
                                                               微孔板浸入不同质量浓度的 SMCC 溶液中 4 h 进行
            技术，以丙烯酰胺等离子体引发活化 PS 微孔板，调
                                                               SMCC 接枝，反应完成后反复用 DMSO 和去离子水
            节其表面形貌及活性，在 PS 微孔板表面接枝 SMCC
                                                               清洗，直至完全除去表面未聚合的单体（采用紫外-
            偶联剂，通过化学吸附结合蛋白；研究不同因素对                             可见分光光度计测试每一遍清洗微孔板后的清洗
            PS 微孔板表面改性效果的影响及蛋白的结合情况，
                                                               液，根据吸光度判断其是否含有 SMCC，直至清洗
            旨在开发蛋白吸附性能稳定、检测灵敏性高的 PS
                                                               液不再含有 SMCC），将得到的 PS-g-SMCC 微孔板
            微孔板。其制备流程示意图如下所示：                                  于 60 ℃下干燥 6 h，备用。

                                                               1.2.3   标准曲线的绘制
                                                                   参照文献[21]的方法，将 BSA 用 PBS 缓冲液
                                                               （pH=7.4）配制成质量浓度分别为 0.2、0.4、0.8、
                                                               1.2、1.6、2.0 mg/L 的溶液，采用 TMB 显色方法
                                                               通过酶标仪测量 450 nm 下溶液的光密度（OD）
                                                               值，绘制 BSA 质量浓度(x)-OD 值(y)标准曲线，得
                                                                                                           2
                                                               到标准曲线 方程为： y=0.21300x+0.12301 ， R =
                                                               0.99654。
   75   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85