Page 162 - 《精细化工》2022年第1期

·152· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷

测定样品溶液的吸光度。 根据文献[11]方法作适当修改。乳状液制备结束后静
1.2.5 表面巯基含量测定 置 1 min，从烧杯底部取 50 μL 乳液加到 5 mL 1.0 g/L
参考 WANG 等 [14] 方法略作修改。将 20 g/L 蛋 SDS 中，混匀后在 500 nm 下测定溶液吸光度，记为
白溶液离心后取上清液，用 pH 7.0、50 mmol/L 磷 A 1 ；60 min 后再从烧杯底部取 50 μL 乳液同上操作，
酸缓冲液稀释至 2 g/L；取 2 mL 稀释液加入新鲜制 吸光度记为 A 60 。根据公式（3）、（4）计算 EAI（m /g）
2
备的 50 μL 浓度为 10 mmol/L DTNB，避光反应 和 ESI（%）。
15 min 后测定在 412 nm 波长下溶液的吸光度，根据 EAI(m /g)  2TA  N /[10  4 (1  )  ] （3）
2
1
公式（2）计算 SH 含量（μmol/g）。 ESI/%  A / A  100 （4）
SH(μmol / g)  A  10 / (  6 ) （2） 60 1
412 式中：T 为转化系数，为 2.303；N 为稀释倍数，201；
–1
式中：A 412 为 412 nm 下溶液的吸光度，cm ；ρ 为 φ 为分散相的体积分数，为 0.25；ρ 为乳化前蛋白质
蛋白质量浓度，为 2 g/L；ε 为消光系数，为 13600
量浓度，为 20 g/L。
L/(mol·cm)。
1.2.12 乳状液的微观结构
1.2.6 紫外全波长扫描 选取空白对照组（即无氨基酸加入且无 pH 调
采用 pH 7.0、50 mmol/L 磷酸缓冲液将配制的
节）、3 g/L L-Arg、3 g/L L-Lys 处理组和相应 pH 对
初始蛋白溶液稀释至 1 g/L，取样 2 μL 在超微量分
[5]
照组的乳状液进行微观结构观察。参考 LI 等 的方
光光度计上进行全波长扫描。设置波长范围为
法，采用激光共聚焦显微镜观察乳状液微观结构。
220~400 nm。
1.2.7 内源荧光扫描 取 1 mL 新鲜制备的乳液与 40 μL 复合染料（1.0 g/L
尼罗红和 1.0 g/L 耐尔蓝 A 等体积混匀，二者溶剂均
参考文献[15]方法并适当修改。在酶标仪上记
为丙酮）充分混合，置于 4 ℃冰箱避光存放 30 min，
录样品的色氨酸（Trp）荧光光谱曲线。取 1.2.6 节
然后取少量染色后的样品于载玻片中央，盖盖玻片
中 1 g/L 的稀释液于 96 孔板，采用荧光光谱检测模
式，设置激发波长(λ ex )为 295 nm，发射波长(λ em )为 时避免产生起泡。λ ex =488 nm，λ em =633 nm。采用×10
320~ 400 nm，扫描速率为 1 nm/s。 目镜，×40 物镜，选择典型形貌区观察并拍照，其
1.2.8 表面疏水性测定 中脂肪球被染为红色，蛋白质被染为绿色。
蛋白质表面疏水性的测定根据参考文献[16]方 1.3 数据处理
法作适当修改。根据预实验结果，将 1.2.6 节中 1 g/L 所有数据重复测定 3 次，以“平均值±标准偏差”
的蛋白溶液进一步稀释至 0.1~0.5 g/L 梯度，然后每 表示。使用 Statistix 9 软件（美国佛罗里达州塔拉哈
个样品的梯度稀释液各取 2 mL，分别加入 20 μL 西分析软件公司）进行统计分析。显著性水平设为
10 mmol/L 疏水荧光探针 ANS-Mg，室温下避光反 α=0.05；用最小显著性差异法检验数据间的差异显
应 15 min 后，在酶标仪上测定其荧光强度；设置 著性，用 p<0.05 表示。
λ ex =365 nm，λ em =484 nm。以蛋白质量浓度（g/L）
为横坐标，荧光强度为纵坐标，拟合一条回归直线， 2 结果与讨论
其斜率即为样品的表面疏水性。 2.1 Arg/Lys 对 SPI 溶解性及浊度的影响
1.2.9 SPI 溶液的 ζ-电位与平均粒径测定
溶解度是衡量蛋白质水化能力的重要指标之
参考文献[17]方法，采用纳米粒度电位仪测定
一，而溶解度的高低可能影响到蛋白质重要功能性
蛋白粒径大小和 ζ-电位。测定粒径时采用光径为 1
之一的乳化性 [18] 。不同处理方式下的 SPI 溶解度如
cm 的粒径专用池，上样量为 1 mL，参数设置：测
定温度为 25 ℃，分散剂为水，折光率为 1.330，平 图 1A 所示，1、3 g/L 的 L-Arg、L-Lys 添加量均显
著提升蛋白质溶解度，且溶解度随碱性氨基酸添加
衡时间 120 s；测定电位时采用可抛弃折叠毛细管样
量的增加而增加，反映出添加剂分子与蛋白质之间
品池，样品溶液蛋白质量浓度为 0.2 g/L。 [2,19] [1]
1.2.10 大豆蛋白乳状液的制备 存在着弱相互作用 。文献显示 ，L-Arg、L-Lys
每组样品各取 80 mL 质量浓度为 20 g/L 蛋白溶 的等电点（pI）分别为 10.76 和 9.74，明显大于 SPI
液，分别与 20 mL 大豆油混合。利用高剪切分散乳 （pI≈4.5），故 BAA 的引入会引起体系 pH 的显著
化机在转速 13000 r/min 下间歇处理 2 min（分 3 次， 提升，而 pH 的升高使 SPI 更加偏离其等电点，蛋
间隔 5 s，每次 40 s）；在整个剪切过程中样品始终 白质微粒表面电荷增加导致的分子间静电斥力加
处于冰水浴中。 强，最终提高了蛋白质的溶解度。为此，本文特设
1.2.11 乳状液的乳化活性与乳化稳定性测定 置了 pH 对照组，即在不添加 L-Arg、L-Lys 条件下，
乳化活性指数（EAI）和乳化稳定性指数（ESI） 调节 SPI 溶液的 pH 与各 BAA 处理组相同。从图 1A