Page 120 - 《精细化工》2022年第10期

·2054· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷

的溶液，然后加入 30 μL 的三乙胺，室温避光搅拌 DLE / %  装载的药物的质量  100 （2）
24 h，得到脱除 HCl 的 DOX。将 CS-NID（10 mg， 投入的药物的总质量
–4
2×10 mmol）溶解在 10 mL pH=3.0 的 HCl 水溶液 胶束的缺氧响应性：将新鲜制备的 0.33 g/L 的
中，冰浴、超声条件下（P=100 W，工作 2 s，间歇 CS-NID 胶束经 3 g/L 的 Na 2 S 2 O 4 分别处理 1、2、3、
2 s，10 min）将 5 mL DOX 的 DMSO 溶液（共 2 mg 6、12 h，测定不同处理时间紫外光谱变化、胶束的
DOX）逐滴滴加至 CS-NID 溶液中，将胶束溶液转 粒径和 Zeta 电位的变化。
移至截留相对分子质量为 3500 的透析袋中，透析 缺氧条件下体外药物释放：将 3 mL 装载 DOX
24 h 除去 DMSO 和未包裹的 DOX，制得装载 DOX 的 CS-NID 胶束转移至截留相对分子质量为 3500 的
的胶束（DOX@CS-NID）。 透析袋中，然后将透析袋浸没在含 Gl（20 mmol/L）+
1.3 结构表征与性能测试 GOx（酶活性 4 unit/mL）+NADPH（100 mmol/L）
临界胶束浓度（CMC）的测定：采用芘荧光探 的 PBS（0.01 mol/L，pH=7.4）溶液中，密封，间
针法测定胶束的 CMC [10] ，配制一系列质量浓度分别 隔一定时间取出 3 mL 溶液，用紫外-可见光谱测得
为 0.25、0.1、0.075、0.05、0.025、0.01、0.0075、 标准曲线，进而测定释放到溶液中的 DOX 含量，
0.005、0.0025、0.001 g/L 的 CS-NID 胶束溶液（溶 同时立即补充 3 mL Gl（20 mmol/L）+GOx（酶活
–7
液中芘的最终浓度为 6×10 mol/L），室温下避光振 性 4 unit/mL）+ NADPH（100 mmol/L）的 PBS 溶液。
荡 12 h，测定溶液中芘的荧光发射光谱，激发波长 常氧条件下的体外药物释放：将 3 mL 装载 DOX
336 nm，激发狭缝宽度 5.0 nm，扫描波长范围为 的 CS-NID 胶束转移至截留相对分子质量为 3500 的
360~480 nm。 透析袋中，然后将透析袋浸没在含有 100 mmol/L
胶束的粒径与 Zeta 电位测定：采用多角度粒度 NADPH 的 PBS（0.01 mol/L，pH=7.4 或 pH=5.4）
及高灵敏度 Zeta 电位分析仪在 25 ℃下测定胶束（质 溶液中，间隔一定时间取出 3 mL 溶液，测定溶液中
量浓度 0.33 g/L）的流体力学直径（波长 λ= 640 nm， 的 DOX 含量，同时立即补充 3 mL 新鲜的含有
o
角度=90 ，测量次数 n=3）和 Zeta 电位值（λ=640 nm， 100 mmol/L NADPH 的 PBS 溶液。累计药物释放率
计算公式见式（3）。
扫描次数=30，平衡时间=300 s，测量次数 n=3）。通
过测定相同条件下 10 d 内的胶束粒径和 Zeta 电位的 累计药物释放率/%=[V 1 ρ n +(ρ 1 +ρ 2 +……+ρ n–1 )V 2 ]/
变化评估胶束的稳定性。 装载药物的质量×100 （3）
胶束的形貌和尺寸通过 TEM 观察，样品的制备 式中：ρ 1 ~ρ n 为每次取样由 480 nm 处 DOX 的吸光度
过程参考文献[6]，将胶束溶液滴在带有铜网的透射 测定的释放液中 DOX 的质量浓度（g/L）；n 表示
碳膜上，待水几乎挥发后，滴加适量质量分数为 1% 药物释放过程中取样次数；V 1 为释放外液缓冲液的
的磷钨酸溶液进行染色。 初始 体积（ 30 mL ）； V 2 表示每 次取样 的体积
采用黏蛋白微粒结合法评价胶束的黏膜黏附 （3 mL）。
性 [22] ：将 20 mg 猪胃黏蛋白分散在 4 mL 醋酸盐缓
冲液（2 mmol/L，pH=4）中，37 ℃孵育 12 h，然后 2 结果与讨论
用细胞粉碎机超声 30 min，4000 r/min 离心 30 min， 2.1 CS-NID 的表征
收集上清液，测量黏蛋白的粒径大小。将 CS-NID NIHA 的 HNMR 谱图如图 2a 所示。图 2a 中，
1
胶束溶液与等体积的黏蛋白分散液混合均匀，37 ℃ δ=7.66（标记为 m）和 δ=7.13（标记为 n）处为硝基
培育 30 min，然后测定混合后的 CS-NID 胶束和黏 咪唑环上的质子峰 [20] ，δ=12（标记为 z）处对应于
蛋白结合物的粒径。 羧基的质子峰。同时 ESI-MS 的测试结果为 m/Z：
载药率（DLC）和包封率（DLE）的测定：由 –
226.08[M–H] 。证实成功合成了 NIHA。CS-NID 8.9
紫外-可见吸收光谱测定 DOX 在 DMSO 中的标准工 的 HNMR 谱如图 2b 所示。图 2b 中，δ=2.9~3.1 处
1
2
作曲线为 y=0.02272x–0.00584，R =0.9994。将载药 为 C2 葡糖胺环相关的质子峰（标记为 2） ，δ=7.00
[23]
胶束稀释至 CMC 以下，–55 ℃冷冻干燥 24 h 后再 和 7.30 处为硝基咪唑环上质子峰（标记为 m 和 n）。
用 DMSO 复溶，由紫外光谱根据标准工作曲线测定 取代度定义为每 100 个壳聚糖重复结构单元上接枝
DOX 的质量。DLC 和 DLE 按式（1）和式（2）进 的 NID 平均数，可以通过 HNMR 图中峰 n+m 积分
1
行计算（其中，装载的药物的质量为载药胶束复溶 面积与峰 2 积分面积比近似计算。因更高取代度的
后溶液在 480 nm 处的吸光度计算得到的 DOX 质 CS-NID 在水中的溶解性变差，如 DS=11.1%的
量，聚合物的总质量为投入的壳聚糖胶束的质量）： CS-NID，室温下高速搅拌 3 d 仍不溶解。所以，本
装载的药物的质量
DLC / %   100 （1） 文应用取代 度较低的 CS-NID 3.9 、 CS-NID 6.3 和
聚合物的总质量 CS-NID 8.9 来制备胶束。