Page 117 - 《精细化工》2022年第12期

第 12 期 郭 尚，等: 蚕蛹虫草生物活性肽的制备及其性能分析 ·2483·

酸调节溶液 pH 至 5.0，静置 0.5 h，在 5000 r/min 下 表 1 蚕蛹虫草多肽酶解正交实验因素水平表
离心 10 min，收集上清液，按照 1.2.1 节方法进行蚕 Table 1 Table of factor level in orthogonal experiment of
enzymatic hydrolysis on Cordyceps militaris
蛹蛋白质含量（质量分数，下同）的测定。
水平 pH 温度/℃ 加酶量/(U/mL) 酶解时间/h
1.2.4.2 超声法提取蚕蛹虫草蛋白质的单因素实验
1 7.2 54 6000 3.0
按照 1.2.4.1 节实验方法，超声法提取蚕蛹虫 2 7.5 55 7000 3.5
草蛋白质的条件为 pH 8.0、提取温度 50 ℃、提取 3 7.8 56 8000 4.0

时间 0. 5 h、料液比 1︰20、超声功率 100 W。固定
1.2.6 超滤法分离蚕蛹虫草多肽
其他条件，分别考察 pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、
4
采用超滤膜（相对分子质量分别为 3.0×10 、
7.5、8. 0、8.5 和 9.0）、料液比（1∶5、1∶10、1∶ 4 3
1.0×10 、3.0×10 Da）依次对蚕蛹虫草蛋白质酶解
15、1∶20、1∶25、1∶30 和 1∶35）、提取时间（0.5、 3
液进行分离，收集滤液（相对分子质量<3.0×10
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 和 3.5 h）、超声提取次数 Da），冷冻干燥后粉碎，过 40 目筛，得到蚕蛹虫草
（1、2、3、4 次）这 4 个因素对提取液中蛋白质 多肽粉末。
含量的影响。 1.2.7 蚕蛹虫草多肽生物学活性的测定
1.2.4.3 超声法制备蛋白质提取液正交优化 1.2.7.1 抗氧化活性的测定
根据单因素实验结果，再以 pH（8.0、8.5、9.0）、 参照文献[17-19]的研究方法进行检测。
料液比（1∶25、1∶28、1∶30）、提取时间（3.0、 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除
3.2、3.5 h）和提取次数（2、3、4）4 个因素，以蛋 活性测定：将 1.2.6 节中所得蚕蛹虫草多肽粉末 100 μg
白质含量为指标设计正交实验。 放入 10 mL 试管中，接着加入 4 mL DPPH（体积分
1.2.5 蚕蛹虫草蛋白质的酶解 数 0.004%）甲醇溶液，剧烈摇动，摇匀后置于黑暗
1.2.5.1 水解酶种类 处反应 30 min，5000 r/min 离心 10 min，取上清液，
将 1.2.4 节所得蚕蛹虫草蛋白质提取液真空冷 采用紫外-可见分光光度计在 517 nm 处测定溶液的
吸光度，按式（1）对 DPPH 自由基清除率进行计算：
冻干燥，将得到粗蛋白质粉末，溶于蒸馏水中，得
到质量浓度为 20 g/L 的水溶液，选用碱性蛋白酶、 R 1 / %   1  A  A  2   100 （1）
1
中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶 5  A 0 
种蛋白酶，加酶量均为 3000 U/mL，依据不同酶的 式中：R 1 为 DPPH 自由基清除率，%；A 1 为样品吸
最佳反应条件，调节溶液 pH 和温度进行酶解，得 光度；A 2 为不加 DPPH 自由基的吸光度；A 0 为空白
对照组吸光度。
到最佳蛋白酶。
羟自由基清除活性的测定：采用水杨酸法 [20-21] 。
1.2.5.2 蚕蛹虫草蛋白质酶解单因素实验
准确配制一系列质量浓度梯度（0、0.4、0.8、1.2、
将质量浓度为 20 g/L 的粗蛋白质水溶液在 pH
1.6、2.0 g/L）的蚕蛹虫草多肽水溶液（相对分子质
7.0、温度 50 ℃、加酶量 6000 U/mL、酶解时间 1 h
3
量<3.0×10 Da）， 向试管 中分 别加入 9 mmol/L
条件下进行酶解。固定其他反应条件，分别考察 pH
FeSO 4 •7H 2 O 溶液 1.0 mL、9 mmol/L 水杨酸乙醇溶
（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、加酶量（2000、
液 1.0 mL，最后加入 2 mL 8.8 mmol/L H 2 O 2 启动反
4000、6000、8000、10000 U/mL）、酶解温度（45、
应，在 37 ℃恒温反应 30 min，在 510 nm 波长下测
50、55、60、65、70 ℃）、酶解时间（1、2、3、4、
定溶液的吸光度，按式（2）对羟自由基的清除率进
5 h）对蚕蛹虫草多肽含量的影响。加入蛋白酶充分 行计算：
振荡后，置水浴中进行酶解，酶解完成后，置沸水浴  A  A 
R /%  1  3 4   100 （2）
中酶灭活 10 min，酶解液在 3500 r/min 下离心 15 min， 2 A
 0 
收集上清液，利用三氯乙酸（TCA）沉淀上清液中未 式中：R 2 为羟自由基清除率，%；A 3 为样品吸光度；
水解的蛋白质，在 3500 r/min 下离心 15 min，收集上 A 4 为不加羟自由基的吸光度；A 0 为空白对照组吸光度。
清液，待测。 1.2.7.2 抗菌活性的测定
1.2.5.3 酶解法制备蚕蛹虫草多肽正交优化 采用纸片扩散法测定其抑菌效果 [16] 。首先，通
选取上述单因素条件，选择 pH、酶解温度、加 过涂布法将细菌接种到平板上（使细菌在平板上能
酶量和酶解时间 4 个因素作为实验因子，以酶解后 够形成一层均匀的菌膜）；然后，将浸有 20 μL 质量
酶解液中蚕蛹虫草多肽含量作为指标，进行正交实 浓度为 100 mg/L 蚕蛹虫草多肽水溶液（相对分子质
3
验，实验因素及水平见表 1。 量<3×10 Da）的滤纸片（0.5 mm×0.5 mm）贴在平