Page 122 - 《精细化工》2022年第12期
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·2488·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 39 卷

                 多肽含量和酶解的温度有很大的关系(图 4c),                       高于正交实验中任一批次,表明正交实验取得了预
            当酶解温度为 55  ℃时,多肽含量最高(16.30%),                      期的效果。这一结果同时表明,碱性蛋白酶与木瓜
            当温度继续升高时,多肽含量呈下降趋势,其原因                             蛋白酶(酶活力比 4∶3)对蚕蛹虫草蛋白质的水解
            可能与酶的本质是蛋白质有关,当温度升高到一定                             具有一定的协同效应,在一定的条件下两种酶的复
            水平,酶活力会降低甚至失活。                                     合作用效果明显优于其单独酶解效果                 [35-36] 。
                 在酶解的初始阶段,多肽含量随着酶解时间的                          2.4   超滤法分离
            延长而升高(图 4d),当酶解时间达到 3 h 时,多肽含                          将最佳提取条件下酶解得到的蚕蛹虫草多肽液
                                                                                                           4
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            量达到最高值(15.30%),但随着时间的继续延长,                         通过分子切割量为相对分子质量 3.0×10 、1.0×10 、
                                                                     3
            多肽含量反而呈下降趋势,可能与底物酶解完全有关。                           3.0×10 Da 的 3 种超滤膜分别对蚕蛹虫草多肽进行
                 因此,蚕蛹虫草蛋白质酶解的最佳条件为:最                          分离,可获得 4 个组分:组分Ⅰ相对分子质量>3.0×
                                                                 4
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            佳 pH 为 7.5、最佳加酶量为 6000 U/mL、最佳温度                   10  Da、1.0×10 Da<组分Ⅱ相对分子质量<3.0×10  Da、
                                                                                                    4
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            为 55  ℃、最佳时间为 3 h。                                 3.0×10  Da<组分Ⅲ相对分子质量<1.0×10 Da 和组
                                                                                      3
            2.3.3   蚕蛹虫草多肽酶解正交实验结果                             分Ⅳ相对分子质量<3.0×10  Da,分别冷冻干燥,置
                 根据上述单因素考察结果,对 pH(A)、酶解温                       于干燥器中保存,备用。JOEN 等              [37] 采用复合酶解
            度(B)、酶解时间(C)和加酶量(D)4 个因素进                          技术酶解鳕鱼蛋白质,并用超滤技术对鳕鱼蛋白质
            行了正交实验优化,结果见表 5。                                   水解物进行分离纯化,获得 3 个肽片段,分离效果
                                                               较好。由此看来,超滤可以有效地分离多肽。
                 表 5   蚕蛹虫草多肽酶解正交实验结果与分析                       2.5   蚕蛹虫草多肽的抗氧化活性
            Table 5    Results and analysis of orthogonal experiment of   DPPH 自由基清除法是在体外条件下检测抗氧
                    Cordyceps militaris polypeptides
                                                               化剂清除自由基最常用的方法。DPPH 自由基结构
                           B(温度) C(时间) D(加酶量)      多肽含
              编号    A(PH)                                      简单、反应易控制,在 517 nm 波长处有特征吸收峰,
                             /℃     /h    /(U/mL)   量/%
             1        1      1      1      1     13.46±0.05 *  已广泛用于检测天然物质抗氧化能力。DPPH 自由
             2        1      2      2      2     16.42±0.08 *  基具有单个且结构相对稳定的自由基,当其与清除
             3        1      3      3      3     12.31±0.08 *  剂相互作用时,溶液的颜色会发生改变                  [22] 。羟自由
             4        2      1      2      3     15.46±0.05 *  基是一种活性氧,其毒性极强,对人体会产生非常
             5        2      2      3      1     15.03±0.12 *  大的危害,在机体内,其可造成多种生物大分子被
             6        2      3      1      2     14.98±0.11 *  破坏,最后导致细胞坏死或突变              [38] ,进而引起疾病。
             7        3      1      3      2     15.66±0.32 *  如果在反应体系中加入具有清除羟自由基能力的物
             8        3      2      1      3     16.12±0.13 *  质,便会与水杨酸竞争羟自由基,使有色物质生成
                                                                                                        3
             9        3      3      2      1     15.09±0.09 *  量减少。蚕蛹虫草多肽(相对分子质量<3.0×10  Da)
             K1      47.70   48.92  47.66  46.79               清除 DPPH 自由基和羟自由基的活性见图 5a、b。
             K2      47.78   49.04  48.77  48.76                   由图 5a 可知,在质量浓度 0~0.8 g/L 范围内,
             K3      48.01   50.01  49.93  49.09               蚕蛹虫草多肽与抗坏血酸(V C )对 DPPH 自由基的
             k1      16.13   15.66  16.23  15.77               清除作用均随样品质量浓度的增加呈上升趋势,之
             k2      15.96   15.98  15.88  13.82               后随着质量浓度增加,抗氧化性增长趋势缓慢直至
             K3      15.99   14.98  14.97  16.01               平稳。尽管多肽与 V C 对 DPPH 自由基的清除作用存
             极差 R     0.26   2.01   2.13   1.09                在一定的差距,但蚕蛹虫草多肽对 DPPH 自由基有
             主次顺序  C>B>D>A                                     显著的清除作用。
             优水平     A1     B2     C2     D2                       如图 5b 所示,在 0~3 g/L 质量浓度范围内,羟
             优组合     A1B2C2D2                                  自由基的清除能力与样品质量浓度呈正相关。当
                    *
                 注: 与对照组比较,P<0.05。                             样品质量浓度为 3 g/L 时,蚕蛹虫草多肽与 V C 的
                                                               羟自由基清除率分别为 50.42%和 92.67%,尽管两
                 从表 5 得到的最优组合 A1B2C2D2(最佳酶解条                   者清除羟自由基的能力存在一定的差距,但也表
            件为:pH=7.2、温度 55  ℃、加酶量 7000 U/mL、                  明,蚕蛹虫草多肽具有较强的提供电子或者氢原
            酶解时间 3.5 h)进行验证实验,多肽含量为 16.73%,                    子能力。
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