Page 122 - 《精细化工》2022年第12期
P. 122
·2488· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷
多肽含量和酶解的温度有很大的关系(图 4c), 高于正交实验中任一批次,表明正交实验取得了预
当酶解温度为 55 ℃时,多肽含量最高(16.30%), 期的效果。这一结果同时表明,碱性蛋白酶与木瓜
当温度继续升高时,多肽含量呈下降趋势,其原因 蛋白酶(酶活力比 4∶3)对蚕蛹虫草蛋白质的水解
可能与酶的本质是蛋白质有关,当温度升高到一定 具有一定的协同效应,在一定的条件下两种酶的复
水平,酶活力会降低甚至失活。 合作用效果明显优于其单独酶解效果 [35-36] 。
在酶解的初始阶段,多肽含量随着酶解时间的 2.4 超滤法分离
延长而升高(图 4d),当酶解时间达到 3 h 时,多肽含 将最佳提取条件下酶解得到的蚕蛹虫草多肽液
4
4
量达到最高值(15.30%),但随着时间的继续延长, 通过分子切割量为相对分子质量 3.0×10 、1.0×10 、
3
多肽含量反而呈下降趋势,可能与底物酶解完全有关。 3.0×10 Da 的 3 种超滤膜分别对蚕蛹虫草多肽进行
因此,蚕蛹虫草蛋白质酶解的最佳条件为:最 分离,可获得 4 个组分:组分Ⅰ相对分子质量>3.0×
4
4
4
佳 pH 为 7.5、最佳加酶量为 6000 U/mL、最佳温度 10 Da、1.0×10 Da<组分Ⅱ相对分子质量<3.0×10 Da、
4
3
为 55 ℃、最佳时间为 3 h。 3.0×10 Da<组分Ⅲ相对分子质量<1.0×10 Da 和组
3
2.3.3 蚕蛹虫草多肽酶解正交实验结果 分Ⅳ相对分子质量<3.0×10 Da,分别冷冻干燥,置
根据上述单因素考察结果,对 pH(A)、酶解温 于干燥器中保存,备用。JOEN 等 [37] 采用复合酶解
度(B)、酶解时间(C)和加酶量(D)4 个因素进 技术酶解鳕鱼蛋白质,并用超滤技术对鳕鱼蛋白质
行了正交实验优化,结果见表 5。 水解物进行分离纯化,获得 3 个肽片段,分离效果
较好。由此看来,超滤可以有效地分离多肽。
表 5 蚕蛹虫草多肽酶解正交实验结果与分析 2.5 蚕蛹虫草多肽的抗氧化活性
Table 5 Results and analysis of orthogonal experiment of DPPH 自由基清除法是在体外条件下检测抗氧
Cordyceps militaris polypeptides
化剂清除自由基最常用的方法。DPPH 自由基结构
B(温度) C(时间) D(加酶量) 多肽含
编号 A(PH) 简单、反应易控制,在 517 nm 波长处有特征吸收峰,
/℃ /h /(U/mL) 量/%
1 1 1 1 1 13.46±0.05 * 已广泛用于检测天然物质抗氧化能力。DPPH 自由
2 1 2 2 2 16.42±0.08 * 基具有单个且结构相对稳定的自由基,当其与清除
3 1 3 3 3 12.31±0.08 * 剂相互作用时,溶液的颜色会发生改变 [22] 。羟自由
4 2 1 2 3 15.46±0.05 * 基是一种活性氧,其毒性极强,对人体会产生非常
5 2 2 3 1 15.03±0.12 * 大的危害,在机体内,其可造成多种生物大分子被
6 2 3 1 2 14.98±0.11 * 破坏,最后导致细胞坏死或突变 [38] ,进而引起疾病。
7 3 1 3 2 15.66±0.32 * 如果在反应体系中加入具有清除羟自由基能力的物
8 3 2 1 3 16.12±0.13 * 质,便会与水杨酸竞争羟自由基,使有色物质生成
3
9 3 3 2 1 15.09±0.09 * 量减少。蚕蛹虫草多肽(相对分子质量<3.0×10 Da)
K1 47.70 48.92 47.66 46.79 清除 DPPH 自由基和羟自由基的活性见图 5a、b。
K2 47.78 49.04 48.77 48.76 由图 5a 可知,在质量浓度 0~0.8 g/L 范围内,
K3 48.01 50.01 49.93 49.09 蚕蛹虫草多肽与抗坏血酸(V C )对 DPPH 自由基的
k1 16.13 15.66 16.23 15.77 清除作用均随样品质量浓度的增加呈上升趋势,之
k2 15.96 15.98 15.88 13.82 后随着质量浓度增加,抗氧化性增长趋势缓慢直至
K3 15.99 14.98 14.97 16.01 平稳。尽管多肽与 V C 对 DPPH 自由基的清除作用存
极差 R 0.26 2.01 2.13 1.09 在一定的差距,但蚕蛹虫草多肽对 DPPH 自由基有
主次顺序 C>B>D>A 显著的清除作用。
优水平 A1 B2 C2 D2 如图 5b 所示,在 0~3 g/L 质量浓度范围内,羟
优组合 A1B2C2D2 自由基的清除能力与样品质量浓度呈正相关。当
*
注: 与对照组比较,P<0.05。 样品质量浓度为 3 g/L 时,蚕蛹虫草多肽与 V C 的
羟自由基清除率分别为 50.42%和 92.67%,尽管两
从表 5 得到的最优组合 A1B2C2D2(最佳酶解条 者清除羟自由基的能力存在一定的差距,但也表
件为:pH=7.2、温度 55 ℃、加酶量 7000 U/mL、 明,蚕蛹虫草多肽具有较强的提供电子或者氢原
酶解时间 3.5 h)进行验证实验,多肽含量为 16.73%, 子能力。