Page 142 - 《精细化工》2022年第3期

·564· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 39 卷

波长下测定吸光度 A 1 。样品对照组用去离子水代替 1.2.4.2 丹参挥发油对酪氨酸酶的抑制类型测试
过氧化氢，测得吸光度 A 2。空白组用去离子水代替样 在酶活力测定体系中，固定加入 50 U/mL 酪氨
酸酶液体积为 50 μL，改变底物 L-DOPA 添加量（添
液，测得吸光度 A 0 。每组实验平行测试 3 次。V C
作为阳性对照。清除率计算如式（3）所示： 加浓度依次为 10、8、5、4、2 mmol/L，体积均为
A  (A  A ) 100 L），在一定质量底物下，分别测定酪氨酸酶在
清除率 / %  0 1 2  100 （3）
A 0 不同质量浓度丹参挥发油溶液中的酶活力变化速度
1.2.2.3 抗氧化协同系数（SE）计算 （丹参油溶液质量浓度分别为 100、140、160、
SE 为实验测得的清除率（ESC）与理论计算的 200 mg/L，体积均为 100 L）。以底物 L-DOPA 浓
清除率（TSC）的比值 [19] 。当 SE>1 时，表示有协同 度的倒数（c ）为横坐标，酶反应速率的倒数（V ）
–1
–1
作用；当 SE≤1 时，表示没有明显的协同作用。协
为纵坐标作图，绘制 Lineweaver-Burk 双倒数曲线，
同系数计算如式（4）所示：
双倒数方程如式（7）所示：
ESC
SE= （4） 1 K m 1 1
TSC V  V [] c  V （7）
TSC 按式（5）进行计算： 0 m m
ESC   ESC 式中：V 0 为初速度，ΔOD/min；K m 为米氏常数，mg/L；
TSC/%=(ESC + +ESC ) 1 n  100（5） V m 为最大反应速率，ΔOD/min；c 为底物 L-DOPA
1
n
10 2(n 1)
式中：ESC 1 、…、ESC n 分别为单一样品的实验清除 浓度，mmol/L。
1.2.5 抑菌活性测定
率；n 为体系中组分数量。
1.2.3 酪氨酸酶抑制率测定 1.2.5.1 菌悬液的制备
参照文献[20]方法，实验组反应液包括 0.05 mmol/L 参照文献[21]方法，首先将保存的大肠杆菌和金
磷酸缓冲液（PBS，pH=6.8）50 L、样品溶液 50 L、 黄色葡萄球菌分别接种到液体培养基中，在 37 ℃恒温
50 U/mL 酪氨酸酶溶液 50 L，室温静置 10 min 后， 培养箱中培养 24 h，使用平板计数法测定菌悬液的细
6
7
添加 10 mmol/L L-DOPA 溶液 100 L，将溶液混合 菌总数（CFU），并调整至 1.0×10 ~1.0×10 CFU/mL。
均匀后室温反应 15 min，用多功能酶标仪在 475 nm 1.2.5.2 抑菌圈法
处测定光密度（OD）。对照组以等体积的乙醇代替 用滤纸片法测定抑菌活性 [22] 。取 100 μL 上述菌
样品溶液，每组实验平行测试 3 次，以熊果苷作为 悬液于固体培养基上，涂布均匀，培养皿中间放置
阳性对照组，抑制率计算按式（6）进行： 已灭菌的直径为 6 mm 的圆形滤纸片，滤纸片上加
(OD  OD ) (OD  OD ) 15 μL 样品，培养皿倒置，置于 37 ℃恒温培养箱，

抑制率 /%= A B C D  100 （6）
(OD  OD ) 孵育 20~24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。将溶
A
B
式中：OD A 为有酪氨酸酶液但不含样液的光密度； 解样品的溶剂（DMSO）设为空白对照，氨苄青霉
OD B 为不含酪氨酸酶液和样液的光密度；OD C 为含 素和硫酸链霉素作为阳性对照。实验重复 3 次取平
有酪氨酸酶液和样液的光密度；OD D 为有样液但不
均值。
含酪氨酸酶液的光密度。
1.2.6 细胞毒性测定
1.2.4 丹参挥发油的酪氨酸酶抑制动力学测试 [23-24]
采用 CCK-8 法进行检测 ，HaCaT 细胞作为
1.2.4.1 酪氨酸酶活性抑制的可逆性判断
4
受试对象，调整细胞浓度为 1.010 个细胞/孔，接
参照文献[20]，固定底物 L-DOPA 的量，改变
种到 96 孔板，每孔加入 100 L 细胞悬液。分别配
酶量，分别测定一定体积不同质量浓度丹参挥发油
制质量浓度为 10、50、100、250、500 mg/L 提取物
溶液对酪氨酸酶催化速率的影响。在 96 孔板中分别
溶液，添加到培养板中，于 37 ℃，体积分数为 5%
加入 50 U/mL 酪氨酸酶溶液 20、30、40、50、60 L，
的 CO 2 培养箱中培养 24 h。检测时，弃去上清液，
用 0.05 mmol/L PBS（pH=6.8）补加至 150 L，再加
加入 100 L 体积分数为 10%的 CCK-8 工作液，培
入 100 L 不同质量浓度丹参挥发油溶液，静置 10 min，
养 4 h 后取出。在多功能酶标仪 450 nm 处读取 OD，
再加入 10 mmol/L L-DOPA 溶液 100 L，反应 10 min
每组设 5 个复孔，同时设置空白组（加入不含药物
后在 475 nm 处测定 OD，计算 OD 随时间增长曲线
的斜率即酶活力。空白组为 100 L PBS 代替同体积 的培养基）和对照组（不含药物的细胞）。细胞活力
丹参挥发油溶液。以酶活力对酪氨酸酶的添加量作 按式（8）进行计算：
图，判断丹参挥发油对酪氨酸酶活性的抑制为可逆 细胞活力 /%= (OD 给药孔  OD 空白孔 )  100 （8）
抑制还是不可逆抑制。 (OD 对照孔  OD 空白孔 )