Page 62 - 《精细化工》2022年第5期
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·916·                             精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 39 卷

                                          [7]
            响野生动物和人类的内分泌系统 ，因而，从源头                             国 Sonics 公司；TGL-21M 型高速冷冻离心机，上海
            上去除废水中的 3,4-DCA 具有重要意义。                            卢湘仪离心机仪器有限公司；Spark 10M 型多功能
                 在以往的研究中，微生物在清除污染环境中的化                         酶标仪，瑞士帝肯集团。
            学品残留物及其代谢物方面发挥着重要作用                      [8-11] 。  1.2   菌株来源
            WANG 等   [12] 发现，蛋白核微藻能够通过乙酰化和甲                        某分散染料制造厂生化池废水。
            酰化 3,4-DCA 进行解毒，4.6 mg/L 底物在 7 d 内的                1.3   培养基
            去除率达 75%；TRAVKIN 等         [13] 利用荧光假单胞菌               LB 液体培养基（g/L）：胰蛋白胨为 10，酵母
            （Pseudomonas fluorescens）26-K 处理质量浓度为              提取物为 5，NaCl 为 10。
            75 mg/L 的 3,4-DCA，在不加葡萄糖的条件下，15 d                      LB 固体培养基（g/L）：胰蛋白胨为 10，酵母
            内去除率达 40%；此外，部分真菌也被报道用于处                           提取物为 5，NaCl 为 10，琼脂粉 17。
            理氯代苯胺，如木质素降解菌白腐真 菌                                     MSM 培养基（g/L）：NaCl 为 1，K 2 HPO 4 •3H 2 O
            （Phanerochaete chrysosporium）经过 33 d 培养能够          为 l，(NH 4 ) 2 SO 4 为 l，MgSO 4 为 0.2，l mL 缓冲盐溶
                                [7]
            去除 50%的 3,4-DCA 。以上研究中都存在底物去                       液。缓冲盐溶液（g/L）：FeSO 4 •7H 2 O 为 l，MnCl 2 •4H 2 O
            除率不高的问题，且真菌处理 3,4-DCA 会产生毒性                        为 1，ZnSO 4 •7H 2 O 为 1。
            更强的四氯偶氮苯         [14] 。宋彩霞 [15] 经过一系列条件优           1.4  3,4-DCA 转化菌的筛选及纯化
            化，将恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）S1 对                      将废水 10 mL 接种于 90 mL 3,4-DCA 质量浓度
            30 mg/L 3,4-DCA 在 3 d 内的去除率提高到 63.82%；             为 100 mg/L 的 MSM 培养基中，于 30  ℃，180 r/min 振
            LI 等 [16] 筛选的类香味菌（Myroides odoratimimus）           荡培养至浑浊，用无菌水梯度稀释后涂布于含100 mg/L
            LWD09，4 d 内对 100 mg/L  3,4-DCA 的去除率为               3,4-DCA 的 LB 固体培养基上，30  ℃培养 2～3 d，
            80%。这两种菌株对底物的去除率相对较高，但未                            挑取生长良好，形态和颜色不同的单菌落，经划线
                                                               分离 3～5 次得到纯培养菌落。
            对底物去除机制进行探讨，未阐明底物是彻底降解
                                                               1.5   菌株鉴定
            还是转化为其他物质。
                                                                   菌株经革兰氏染色后光学显微镜下观察细菌形
                 针对以上问题，本研究从染料制造厂生化池废
                                                               态，16S rDNA 序列由上海生工生物工程公司测定，
            水中筛选出能够以 3,4-DCA 为唯一碳源生长的菌
                                                               与 GenBank 数据库中相应序列进行 BLAST 比对，
            株，经形态学观察和 16S rDNA 序列分析鉴定菌株，
                                                               用 MEGA 5.0 构建系统进化树。
            通过构建混合菌群以及条件优化提高菌株对底物的
                                                               1.6   混合菌转化 3,4-DCA 的特性
            去除率。经 GC-MS 分析和相应酶活检测确定菌株代
                                                               1.6.1   菌悬液的制备
            谢的最终产物并探讨其毒性，以期达到高效去除废
                                                                   将纯化后的菌株接种到 LB 液体培养基中，30  ℃、
            水中的 3,4-DCA 并解除其毒性的效果。
                                                               180 r/min 摇床培养 12 h，12000 r/min 离心 5 min，
            1   实验部分                                           弃上清，生理盐水洗涤 3 次，菌体用于制备在 600 nm
                                                               处光密度值（OD 600 ）为 1.6 的菌悬液。
            1.1   试剂与仪器                                        1.6.2  3,4-DCA 转化率的测定
                 K 2HPO 4•3H 2O、(NH 4) 2SO 4、MgSO 4、MnCl 2•4H 2O、  按接种量 2%（体积分数，下同）将 1 mL 菌悬
            ZnSO 4 •7H 2 O、FeSO 4 •7H 2 O、NaCl、二氯甲烷（AR）、       液转接到 49 mL  MSM 培 养基（ 含 100 mg/L
            琼脂粉（BR）、甲醇（色谱级），国药集团化学试剂                           3,4-DCA）中，30  ℃、180 r/min 摇床培养 3 d，检
            有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物，BR，安琪酵母                            测菌液 OD 600 及 3,4-DCA 质量浓度。3,4-DCA 质量
            股份有限公司；5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)、盐酸胍                       浓度采用高效液相色谱法（HPLC，外标法）测定，
            （质量分数 98%），天津希恩思生化科技有限公司；                          液相色谱柱：C 18 柱，4.6 mm×250 mm，5 μm；流动
            乙酰辅酶 A 钠盐（质量分数 93%），上海麦克林生                         相 V(甲醇)∶V(水)=60∶40；流量 1.0 mL/min；柱温
            化科技有限公司。                                           37  ℃；检测波长 254 nm；进样量 10 μL。3,4-DCA
                 SPX-250BSH-Ⅱ型生化培养箱，上海新苗医疗                     转化率的计算式如下所示：
            器械制造有限公司；THZ-072HT 型数控恒温摇床，                                                
                                                                             D /%   1  2   100        （1）
            上海博彩生物科技有限公司；Agilent 1260 高效液相                                           
                                                                                      1
            色谱仪、Agilent 5975-7890 气相色谱-质谱联用仪，                  式中：D 为 3,4-DCA 转化率，%； 1 为处理前 3,4-DCA
            美国 Agilent 科技公司；RE-52AA 型旋转蒸发仪，                    的质量浓度，mg/L； 2 为处理后 3,4-DCA 的质量浓
            上海亚荣生化仪器厂；VCX-500 型超声破碎仪，美                         度，mg/L。
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