Page 63 - 《精细化工》2022年第5期

第 5 期 倪金荧，等: 混合菌的构建及其对 3,4-二氯苯胺的生物转化 ·917·

1.6.3 混合菌群的构建 为粗酶液。
结合菌株形态及转化性能，选取形态及颜色差 采用 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）测定
异较大的两株菌（可能是功能不同的菌株）构建混 游离辅酶 A（CoA）的方法可以测定 N-乙酰基转移
合菌群。按 1.6.1 节分别制备单一菌株的菌悬液，按 酶活性 [17-18] 。酶反应体系如下：粗酶液 50 μL、
1.6.2 节测定混合菌群对 3,4-DCA 的转化率，混合菌 3,4-DCA 25 μL（终浓度 500 μmol/L）、乙酰辅酶 A
群接种量保持 2%不变，两种菌悬液的体积比分别为 25 μL（终浓度 400 μmol/L）于 96 孔板中孵育不同
3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。 时间，以 100 μL 6.4 mol/L 盐酸胍溶液终止反应，加
1.6.4 3,4-DCA 转化条件的优化 入 100 μL 5 mmol/L DTNB 显色后，于 412 nm 处测
单因素预实验：以 1.6.2 节中的转化条件（温度 定吸光度，定义每分钟 1 μmol 底物转化为产物所需
30 ℃、自然 pH、接菌量 2%、摇床转速 180 r/min） 的酶量为一个国际制酶活单位（U）。其他条件相同
为基础，以 3,4-DCA 转化率为指标，初步考察接菌 的情况下，以检测缓冲液代替酶液作为对照。
量（1%、2%、3%、5%、7%）、转化温度（25、30、 游离 CoA 生成量的测定：以不同浓度的 L-半胱
35、40 ℃）、初始 pH（5、6、7、8、9）、摇床转速 氨酸标准溶液制备标准曲线，根据标准曲线方程计算与
（100、150、180、200、250 r/min）对混合菌（P11-1 吸光度变化相对应的游离CoA生成量。酶活计算公式为：
与 L13 体积比为 1:1）转化 3,4-DCA 的影响。 酶活/(U/L)=n/(t×V) （2）
正交实验：选取单因素实验中的摇床转速、温 式中：n 为 CoA 的生成量，μmol；t 为酶促反应时
度和 pH 3 个因素，每个因素设置 3 个水平（其中： 间，min；V 为酶液用量，L。
摇床转速为 190、200、210 r/min；温度为 28、30、
4
32 ℃；pH 为 7、8、9）。通过 L 9 (3 )正交实验（表 2 结果与讨论
1）确定混合菌的最佳转化条件组合，结果用 SPSS 2.1 3,4-DCA 转化菌的筛选与鉴定
软件进行统计分析。 通过 1.4 节分离纯化，筛选得到 5 株 3,4-DCA

表 1 正交实验设计 转化菌株，并按照 1.6.1 节制备菌悬液，按照 1.6.2
Table 1 Orthogonal experimental design 节进行 3,4-DCA 的转化实验，结果见图 1。

影响因素
序号
摇床转速/(r/min) 温度/℃ pH
1 190 28 7
2 190 30 8
3 190 32 9
4 200 28 8
5 200 30 9
6 200 32 7
7 210 28 9
8 210 30 7
9 210 32 8

1.7 代谢产物的测定 图 1 不同菌株对 3,4-DCA 转化的能力
Fig. 1 Transformation ability of different strains to 3,4-DCA
取转化过程中的培养液经 12000 r/min 离心，取
上清液用二氯甲烷按体积比 1∶1 萃取两次，萃取液 根据图 1 挑选转化能力较强，形态与颜色差异
旋转蒸发后用甲醇（色谱级）溶解，得到的有机物 较大的 L13 与 P11-1 作为实验菌株，进行混合菌群
溶液经高效液相色谱分离后再进行 GC-MS 分析。最 的构建。两株菌在 LB 固体培养基上 30 ℃培养 48 h
后，将气相色谱中检测到的各物质的保留时间和质 后的形态见图 2。菌落单一，P11-1 呈均一黄色，圆
谱图与美国标准质谱数据库（NIST）进行比对，分 形隆起，较为湿润；L13 呈蓝绿色，扁平湿润，表
析代谢产物的分子结构。 面略褶皱。两株菌革兰氏染色均显阴性，显微镜下
1.8 菌株酶活测定 呈长短不一的杆状。
粗酶液的制备：取振荡培养 3 d 后的混合菌转 将菌株 16S rDNA 序列与 GenBank 中报道的
化液 50 mL（OD 600 为 0.91），于 12000 r/min 离心 5 min， 16S rDNA 序列进行同源性比对，结果显示与铜绿假
细胞沉淀用检测缓冲液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5） 单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）相似度达 99%以
洗涤并重悬，400 W 超声破碎 90 次（破碎 3 s，间 上。采用 MEGA 5.0 软件构建系统进化树（图 3），结
隔 3 s），4 ℃下 12000 r/min 离心 10 min，取上清液 合菌落形态，初步鉴定为 Pseudomonas aeruginosa。