Page 16 - 《精细化工）》2023年第10期
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·2094·                            精细化工   FINE CHEMICALS                                 第 40 卷

            得高效突变体的最新成果，并提出了未来可继续开                             CO 2 的能力，助力实现“碳中和、碳达峰”的“双
            展的工作设想。                                            碳”目标。
                 WU 等  [40] 对 Candida boidinii 来源的 FDH 进行
            了 Asp195、Tyr196 和 Gln197 残基的定点饱和突变，
                             +
            获得了两个 NADP 依赖型 FDH 突变体。对 NADP                 +
                                              3
                                    4
            的催化效率分别为 1.14×10 和 2.9×10  L/(mols)，这
            两个突变体的催化效率高于来自 C. boidinii 的通过
            顺序诱变获得的突变体。说明这些残基对 FDH 辅因
            子的特异性有重要影响，该研究向着开发高效
                  +
            NADP 依赖型 FDH 目标更进一步。PALA 等              [19] 报道
            了一种来源于 Chaetomium thermophilum  的 NAD         +

            依赖型 FDH（CtFDH），通过活性位点突变增强了
                                                                        –
                                                               图 5  HCO 3 在野生型和突变体 G93H/I94Y 的活性中心的
            CO 2 还原活性。突变体 N120C 具有完全灭活的甲酸                           位置  [20] （HCO 3 的受体碳原子用 C 表示，离开的氢
                                                                                –
                                   –
            盐氧化活性，其对 HCO 3 的还原比活是野生型（未
                                                                    化物在红色圆圈中用灰色条表示）
            突变）的 4.7 倍。突变体的催化转化率（k cat 值）是                     Fig. 5    Positions of HCO 3  in the active site of wild type
                                                                                   –
            野生型的 6.5 倍，但底物结合能力（K m 值）降低了                             and mutant G93H/I94Y [20]  (The acceptor carbon of
                                                                         –
                                –
            6.5 倍，总体上对 HCO 3 的还原具有相同的催化效率。                           HCO 3  is marked with character C and the leaving
                                                                     hydride is shown by grey stick at the red circle)
            通过分子模拟解析突变体活性增强的分子机制，结
            果表明：（1）突变体放松了对底物定位和活性中心
            构象柔性的严格控制，从而导致底物亲和力减弱；                             4    全细胞生物催化 CO 2 还原为甲酸盐
                                   –
            （2）突变体与底物 HCO 3 之间的氢键改善了氢化物                            基于对 FDH 的研究，人们还尝试了全细胞生物
            转移机制，从而提高了催化转化率                [19] 。ÇAKAR 等 [20]  催化法利用 CO 2 生产甲酸盐。SCHUCHMANN 等              [41]
            通过对 CtFDH 进行定向进化，获得了 4 株能提高                        报道了来自 Acetobacterium woodii 的一个依赖 H 2 的
                 –
            HCO 3 催化转化率的突变体。突变体 G93H/I94Y 表
                                                               含钼甲酸脱氢酶，在其催化下以合成气为原料，生
            现出较高的催化转化率和较强的底物结合能力，总                             产了 25 mmol/L 的甲酸盐，催化 CO 2 还原所需电子
            体上其催化效率比野生型高 5.4 倍。突变体 G93H/I94R
                                                               由 H 2 氧化提供。酶催化生产甲酸盐的产量比用碳酸氢
            的催化转化率是野生型的 2.6 倍，但底物亲和力比                                                    [23,42-43]
                                                               钠、CO 2 和 H 2 混合物的产量低            ，可能是由于合
            野生型低 2.3 倍，因此，突变体和野生型的催化效
                                                               成气中 CO 和其他成分的抑制作用。ALISSANDRATOS
            率相差不大。突变体（R259C 和 G93H/I94Y/R259C）
                                                                 [42]
                                                               等 试图在大肠杆菌JM109中过量表达来自Clostridium
            的催化转化率有所提高，但底物亲和力显著减弱，
                                                               carboxidovorans、Methanobacterium thermoformicicum
            从而导致催化效率低于野生型。将突变酶与底物进
                                                               或 Pyrococcus furiosus 的 FDH，以制备用于生产甲
            行分子对接，结果表明，突变体（G93H/I94Y）引
                                                               酸盐的全细胞生物催化剂。在建立的大肠杆菌工程菌
            起了辅因子位置的轻微变化，这可能导致氢从
                                  –
            NADH 快速转移到 HCO 3 （如图 5 所示），从而提高                    中，过量表达 PfFDH 的菌株利用碳酸氢钠和气态氢
                                                                                                          [42]
                                                               生产出44 mmol/L的甲酸盐，其产率为22.7 mmol/(Lh) 。
            了催化转化率和总催化效率。此外，ÇAKAR 等还
                                                               为了开发一种将 CO 2 转为甲酸盐的生物工艺，
            证实了突变体 G93H/I94Y 可与醇脱氢酶共同用于                                    [23]
                 +
            NAD 的再生系统       [20] 。                             MOURATO 等      发现了一种 D. desulfuricans 菌株表
                                    +
                 迄今为止，针对 NAD 依赖型 FDH 的分子改造                     现出很高的催化性能，在批量反应器中生产出
            研究并不多，改造效果也并未达到可用于生产的水                             12 mmol/L 的甲酸盐，产率为 0.09 mmol/(Lh)。他们
            平。在今后研究中，可以基于大数据分析，充分利                             接下来构建了一个利用 CO 2 生产甲酸盐的连续反应
            用 AlphaFold 2.0、ProtENN 深度学习等人工智能技                 器，实现了 45 mmol/L 的甲酸盐产量，产率为
            术，进一步提高甲酸脱氢酶三维结构模拟的精确度、                            0.4 mmol/(Lh)。并且提出了一个生产甲酸盐的代谢
            准确度和速度，为甲酸脱氢酶的辅酶选择性、稳定                             途径，胞质中的甲酸脱氢酶（FdhAB）利用氢化酶
            性和催化活性的理性改造提供坚实的基础。再借助                             （HydAB）驱动的 H 2 氧化所产生的电子催化 CO 2
            全质粒扩增、无缝克隆等现代分子生物学技术，快                             还原为甲酸盐（见图 6）           [23] 。所提出的代谢途径有
            速实现甲酸脱氢酶特定位点的定点突变，高效获得                             助于进一步设计工程菌株，以从 CO 2 中高效生产甲
            性能优良的甲酸脱氢酶突变体，显著提高其还原                              酸盐。
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