Page 126 - 《精细化工》2023年第11期

·2438· 精细化工 FINE CHEMICALS 第 40 卷

表 1 实验中所用菌株的特征与来源
Table 1 Characteristics and origin of strains used in the experiment
②
菌株 特征 来源
①
E. coli JM109 质粒宿主 实验室保藏
BS B. subtilis168 实验室保藏
BS0 B. subtilis168 ΔdeoD 本实验构建
CW1 BS0, pHT-P veg-PyNP1, p43NMK-P 43-PNP1 本实验构建
CW2 BS0, pHT-P veg-PyNP1, p43NMK-P 43-PNP2 本实验构建
CW3 BS0, pHT-P veg-PyNP1, p43NMK-P 43-PNP3 本实验构建
CW4 BS0, pHT-P veg-PyNP1, p43NMK-P 43-PNP4 本实验构建
CW5 BS0, pHT-P veg-PyNP2, p43NMK-P 43-PNP1 本实验构建
CW6 BS0, pHT-P veg-PyNP2, p43NMK-P 43-PNP2 本实验构建
CW7 BS0, pHT-P veg-PyNP2, p43NMK-P 43-PNP3 本实验构建
CW8 BS0, pHT-P veg-PyNP2, p43NMK-P 43-PNP4 本实验构建
CW3-1 CW3, 优化 PyNP1 的 RBS 序列 本实验构建
CW3-2 CW3, 优化 PNP3 的 RBS 序列 本实验构建
CW3-3 CW3, 优化 PyNP1 与 PNP3 的 RBS 序列 本实验构建
CW9 CW3-3, PyNP1 酶 N 端融合 PDZ，PNP3 酶 C 端融合 PDZ lig 本实验构建
CW9-1 CW3-3, PyNP1 酶 N 端融合 PDZ 本实验构建
CW9-2 CW3-3, PNP3 酶 C 端融合 PDZ lig 本实验构建
CW10 CW3-3, PyNP1 酶 N 端融合 RIAD，PNP3 酶 C 端融合 RIDD 本实验构建
CW10-1 CW3-3, PyNP1 酶 N 端融合 RIAD 本实验构建
CW10-2 CW3-3, PNP3 酶 C 端融合 RIDD 本实验构建
CW11 CW3-3, PyNP1 酶 N 端融合 CCDIA，PNP3 酶 C 端融合 CCDIB 本实验构建
CW11-1 CW3-3, PyNP1 酶 N 端融合 CCDIA 本实验构建
CW11-2 CW3-3, PNP3 酶 C 端融合 CCDIB 本实验构建
CW12 CW10, PNP3 酶 C 端融合 2 个 RIDD 标签 本实验构建
CW13 CW10, PNP3 酶 C 端融合 3 个 RIDD 标签 本实验构建
CW14 CW10, PNP3 酶 C 端融合 4 个 RIDD 标签 本实验构建
CW15 CW10, PyNP1 酶 N 端融合 2 个 RIAD 标签 本实验构建
CW16 CW10, PyNP1 酶 N 端融合 3 个 RIAD 标签 本实验构建
CW17 CW10, PyNP1 酶 N 端融合 4 个 RIAD 标签 本实验构建
CW18 CW10, PyNP1 酶 N 端融合 5 个 RIAD 标签 本实验构建
①BS0 为 B. subtilis 168 敲除内源性的 PNP（由基因 deoD 编码，Gene ID: 940038）后的菌株；以 BS0 为出发菌株，经过表中特征栏
中所述操作获得的重组 B. subtilis 菌株分别对应命名为 CW1~CW18。②pHT 与 p43NMK 均为质粒名称，质粒构建信息列于表 2；以
pHT-P veg-PyNP1 质粒为例，该质粒是以 pHT 质粒作为载体，利用启动子 P veg 介导酶 PyNP1 的表达；PyNP1、PyNP2 及 PNP1~PNP4 的来源
和基因序列号在 2.1 节详细说明。PDZ 与 PDZ lig、RIAD 与 RIDD、CCDIA 与 CCDIB 均为互作短肽标签。RBS 为对核糖体结合位点。

培养基中添加相应的抗生素：氨苄青霉素 TGL-10C 飞鸽台式高速离心机，上海安亭科学仪器
100 µg/mL、氯霉素 50 µg/mL、卡那霉素 30 µg/mL、 厂；S210 型 pH 计，瑞士梅特勒-托利多公司。
博莱霉素 30 µg/mL。 1.2 实验方法
T100 聚合酶链反应仪（PCR），美国伯乐公司； 1.2.1 菌株构建
YM 型立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有 质粒表达载体的构建：本文所构建的表达载体
限公司；SW-CJ-1FD 型超净工作台，苏州苏净集团 如表 2 所示。以构建质粒 pHT-P veg-PyNP1 为例，首
安泰空气技术有限公司；ZQZY-108 型实验室恒温 先利用引物 pHT-F1、pHT-R1 以质粒 pHT 为模板进
培养摇床，上海知楚仪器有限公司；1260 型高效液 行扩增得到线性化质粒片段 pHT-1；其次，利用引物
相色谱仪，美国安捷伦科技公司；DF-101S 集热式 PyNP1-F1、PyNP1-R1 从 E. coli BL21 基因组中扩增
恒温加热磁力搅拌器，上海力辰邦西仪器科技有限 出目的基因 PyNP1 片段；之后，利用无缝克隆试剂
公司；Scientz-ⅡD 超声波细胞破碎仪，宁波新芝生 盒将目的基因片段 PyNP1 与线性化质粒片段 pHT-1
物科技股份有限公司；Sorvall Lynx 4000 型落地式 连接转入 E. coli JM109 中，测序选择正确的单菌落
冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技有限公司； 进行培养提取重组质粒 pHT-P veg -PyNP1，备用。